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Los arroyos pampeanos tienen elevados niveles de fósforo y una alta producción primaria, mayoritariamente debida al perifiton. Esta comunidad es esencial en la retención del fósforo. Otra característica relevante de estos arroyos es la presencia de arsénico, considerado tóxico para las algas. La similitud química entre el arseniato, forma oxidada del As, y el fosfato, ocasiona toxicidad celular debida a la competencia por la entrada a la célula lo que, a una escala mayor, deriva en cambios en los procesos ecosistémicos. Nuestros objetivos fueron relevar la calidad del agua de arroyos pampeanos en relación al P y al As y entender el efecto del As sobre el metabolismo, la retención de P y la tolerancia del perifiton a distintas escalas. Se realizaron experimentos en microcosmos, colonizaciones a campo y experimentos en el campo. En microcosmos se observó que la exposición crónica al As y al P aumenta la tolerancia al As y que este disminuye la retención de P del perifiton. Con los sustratos colonizados en el campo se observó que la relación As/P podría explicar el escaso desarrollo de biomasa en algunos ambientes que, aunque tienen adecuadas concentraciones de P, el crecimiento se vería inhibido por altas concentraciones de As. Asimismo, el As reduciría la colonización del perifiton excepto en ambientes con alto contenido de P donde el As reduciría su efecto. Este estudio ayuda a dilucidar las implicancias ecológicas de la presencia de As en arroyos sistemas fluviales. Los cambios en el metabolismo de los organismos, debidos a la exposición crónica al As pueden derivar en una disminución de la retención de nutrientes, una menor eficiencia en la depuración del curso de agua o una menor capacidad para sostener una red trófica.

La interacción entre los complejos inmunes (CI) y los receptores para el fragmento Fc de las inmunoglobulinas G, induce respuestas inmunes regulatorias y efectoras. En este trabajo, nos propusimos investigar el efecto de los CI precipitantes sobre la diferenciación y las funciones biológicas de las células dendríticas (CD) derivadas de monocitos. Demostramos que el agregado de CI al inicio del cultivo altera la normal diferenciación de las CD. Así, las CD-CI diferenciadas durante 6 días en presencia de CI presentaron una baja expresión de los marcadores CD1a, CD1b, y una alta expresión de los marcadores CD14, MHC II y CD68, en comparación con las CD diferenciadas convencionalmente, sin embargo, no observamos diferencias en la expresión del marcador de células dendríticas CD11c. Estas alteraciones en el fenotipo correlacionaron con alteraciones en la morfología de las CD. Asimismo, evaluamos el efecto de CI solubles y observamos que sólo los CI solubles preparados con ligero exceso de antígeno, ejercieron un efecto sobre la diferenciación de las CD similar al observado con CI precipitantes. Demostramos además, que el efecto de los CI es tiempo y dosis dependiente e irreversible. Mediante el uso de anticuerpos bloqueantes específicos para los distintos FcγRs, determinamos que el efecto de los CI, es ejercido principalmente a través del FcγRI y en menor medida a través del FcγRII. Las CD-CI inmaduras mostraron altos niveles de CD83, CD86 y CD40, y el tratamiento con LPS no indujo un aumento en la expresión de las mismas. Esta alteración en la maduración de las CD se encontró asociada con una menor producción de IL-12 en respuesta al LPS, mientras que la producción de IL-10 no se vio alterada. Las CD-CI mostraron un perfil de producción de quimioquinas alterado, con un incremento en la producción de CXCL8, CCL2 y CCL3. Asimismo, las CD-CI mostraron una capacidad reducida para inducir una respuesta T alogénica y una menor capacidad endocítica. Demostramos que el efecto ejercido por los CI es independiente de IL-10 y prostaglandinas, mientras que la inhibición de la p38 MAP quinasa, abolió dicho efecto. Nuestros resultados demuestran que los CI afectan severamente la diferenciación, maduración y las funciones biológicas de las CD. Por esta razón, creemos que este estudio puede contribuir a un mejor entendimiento de los eventos involucrados en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes y los desórdenes inflamatorios crónicos como el lupus eritematoso sistémico (LES), la granulomatosis de Wegener, la crioglobulinemia esencial y artritis reumatoidea (AR).

La autoinmunidad es una causa importante de enfermedad en los seres humanos. El síndrome de Sjögren es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por una pérdida progresiva de la secreción salival y lagrimal. La cepa de ratones diabéticos no obesos (NOD) es el modelo murino más ampliamente utilizado para el estudio de esta enfermedad debido a que el desarrollo de la sialoadenitis está acompañado por una disminución de la respuesta secretoria. Estudios en las glándulas salivales sugieren que el óxido nítrico podría tener un papel en la regulación de la secreción salival. Por tal motivo nuestro objetivo es investigar si la disfunción secretoria de los ratones NOD está asociada a alteraciones en la actividad de la óxido nítrico sintasa y su relación con la aparición de infiltrados linfocitarios en las glándulas o la expresión de citoquinas en las mismas. Los resultados expuestos indican que las glándulas salivales de ratones NOD presentan una menor actividad de NOS a partir de las 12 semanas comparada con la de BALB/c de la misma edad y ratones NOD de 8 semanas. La disminución es total en el caso de las glándulas submaxilares. El efecto sobre la NOS coincide con una reducción del flujo salival estimulado por pilocarpina sola o pilocarpina y VIP. Ambos efectos preceden al aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias en las glándulas y en el suero y a la aparición de infiltrados linfomononucleares en las glándulas. Además los resultados apoyan la hipótesis de una regulación negativa de la NOS por CaM KII, como el mecanismo responsable de la disminución de la actividad observada.

Se evaluaron los síntomas de intoxicación con deltametrina y cis-permetrina en ninfas III de T. infestans. Se estimaron los TE 50s de distintas dosis para dos efectos: (a) incoordinación, y (b) parálisis total. Deltametrina fue tanto o más rápida en producir el primer efecto (según la dosis), cis-permetrina fue más rápida en producir el segundo. No hubo diferencia significativa entre las DE 50 a diferentes tiempos de los dos piretroides, y las ninfas tratadas con cualquiera de ellos mostraron una importante recuperación en función del tiempo. La recuperación fue inhibida cuando se aplicó simultáneamente butóxido de piperonilo. Se estudió la influencia de distintas variables sobre la toxicidad de deltametrina y cis-permetrina. La temperatura tuvo un efecto importante sobre las CE 50s y DE 50s de los piretroides estudiados. En general la toxicidad aumentó al disminuir la temperatura; pero hubo excepciones que dependieron del insecticida, el estadio ninfal y el rango de temperatura. El efecto de la temperatura sobre los TE 50s fue poco importante. En general la velocidad de acción aumentó al disminuir la temperatura; pero hubo excepciones que dependieron del insecticida, el estadio ninfal y el rango de temperatura. En experimentos con ninfas de distintas edades y estados alimentarios, resultaron más sensibles los individuos de 1 día de edad, y más tolerantes los alimentados 7 días antes. La aplicación tópica en el tórax produjo síntomas de intoxicación más rápidamente que la aplicación tópica en el extremo abdominal. Deltametrina actuó más rápidamente que cis-permetrina en un amplio rango de dosis (2-1.000 ng/insecto). En ninfas I, el isómero cis de la permetrina fue más tóxico que el isómero trans a 26 y 36°C, e igual de tóxico a 16°C. El pretratamiento con butóxido de piperonilo sinergizó la toxicidad de cis-permetrina pero no la de trans-permetrina. El pretratamiento con trifenilfosfato tuvo el efecto opuesto. La mezcla de los dos isómeros produjo un efecto de aditividad (ausencia de interacción). En ninfas III, el isómero cis de la permetrina fue más tóxico que el isómero trans a 16 y 26°C, e igual de tóxico a 36°C. Los pretratamientos con butóxido de piperonilo o trifenilfosfato no modificaron las DE 50s. La mezcla de los dos isómeros produjo un efecto de antagonismo. Ambos piretroides produjeron hiperactividad locomotora en ninfas III. Este efecto estuvo influenciado por el modo y el lugar de aplicación de los insecticidas. La hiperactividad fue inhibida por el pretratamiento con N-etilmaleimida y por el descenso de la temperatura. Ninguno de los dos insecticidas tuvo efectos subletales sobre la ingesta y la mortalidad de ninfas I y III, y sólo deltametrina produjo una disminución en la cantidad de ninfas I mudadas.

Se caracterizaron de forma fenotípica y funcional las células dendríticas (CD) derivadas del cultivo de precursores de médula ósea, y se estudió el mecanismo mediante el cual la vacuna CD/Apo-Nec, constituida por CD co-cultivadas con células apoptóticas y necróticas del melanoma murino B16F1 (Apo-Nec), genera protección anti-tumoral. Las CD se separaron empleando microesferas magnéticas anti-CD11c, y las dos poblaciones resultantes en términos de positividad para CD11c (CD+ y CD-), se estudiaron junto a las CD. Se demostró que la población de CD obtenida luego de 7 días de cultivo con el factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos murino (mGM-CSF), es heterogénea y presenta aproximadamente un 60% de CD CD11c+. El 26,6% de las células presentes en la fracción CD+ co-expresó los antígenos de superficie CD11c y F4/80, y el 75,4% resultó ser doble positiva para CD11c y CD11b. La fracción CD+ también expresó Ly6-G. La fracción CD- quedó enriquecida en macrófagos CD11c-/F4/80+ (44,7%), algunos de los cuales co-expresaron Ly6G (41,8%); y en neutrófilos F4/80-/Ly6-G+(34,6%). Las fracciones CD+ y CD- mostraron una capacidad similar para fagocitar y endocitar antígenos, y expresaron niveles similares de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II y moléculas co-estimulatorias CD80, CD83 y CD86, respecto a la población de CD. Sin embargo, sólo la vacuna CD/Apo-Nec fue capaz de conferir una protección significativa. Luego del co-cultivo no se detectó interleuquina-12, ni intracelularmente ni en el sobrenadante de la vacuna CD/Apo-Nec. Por lo cual, la protección obtenida sería independiente de su habilidad para secretar esta citoquina en el momento de ser administrada. No detectamos una polarización de los macrófagos y neutrófilos derivados del cultivo de CD hacia un fenotipo M1/N1 o M2/N2, antes o después del co-cultivo, lo cual podría relacionarse con la falta de expresión de interferón-γ, y de secreción de interleuquina-10 e interleuquina-12 por parte de las células. Las vacunas constituidas por las fracciones CD+ y CD-(CD+/Apo-Nec y CD-/Apo-Nec), indujeron en los sitios de inmunización, la expresión de interleuquina-10 y una elevada producción de óxido nítrico, lo cual podría explicar en parte su incapacidad para conferir protección anti-tumoral. Los resultados obtenidos indicarían que existe una interacción entre las poblaciones celulares que conforman el cultivo de CD. Variaciones en el número de dichas poblaciones resultarían en la falta de protección; por lo cual todas las células presentes en la vacuna CD/Apo-Nec serían necesarias para inducir protección contra el melanoma murino B16-F1.

Este trabajo de Tesis se ha basado en la producción de anticuerpos monoclonales (AMC) dirigidos contra las células troncales de carcinoma mamario humano. la caracterización e identificación de los antígenos (Ag) reconocidos por los mismos y la evaluación de la posible utilidad diagnóstica y terapéutica de dichos AMCs. Para su obtención, se inmunizaron ratones Balb/c con células provenientes de un paciente con un carcinoma de mama agresivo y altamente indiferenciado, negativo para la expresión de ER y PgR, estrategia seguida con la idea de minimizar la producción de AMCs dirigidos contra Ags asociados a la diferenciación celular. De los hibridomas obtenidos fue seleccionado el AMC FC-2.15, de isotipo IgM, el cual reacciona con la mayoría de los carcinomas mamarios humanos, independientemente de su tipo histológico y grado de diferenciación, reconociendo en los mismos al 80 % de las células tumorales y al 90 % de las células proliferantes del tumor, entre las que se encuentran las células troncales. El AMC FC-2.15 reconoce otras neoplasias, como carcinoma de colon y leucemia mieloide crónica y presenta escasa reactividad con la mayoria de los tejidos normales, siendo la principal reacción cruzada con los leucocitos polimorfonucleares (PMN). En cuanto al Ag FC-2.15, la caracterización bioquímica inicial indicó un Ag de naturaleza glicoproteica, residiendo el epitope en la parte hidrocarbonada del mismo. Posteriores experimentos demostraron que el AMC FC-2.15 reconoce específicamente al trisacárido Lewis˟ o CD15, terminalmente expuesto. Esta conclusión está basada tanto en el reconocimiento específico del AMC FC-2.15 por diferentes estructuras conteniendo Lewis˟ como en la inhibición observada en un ELISA realizado utilizando un AMC comercial anti-CD15 como inhibidor. Asimismo, se determinó que el AMC FC-2.15 no presenta reacción cruzada con el tetrasacárido sialil Lewis˟, ni con su isómero Lewisª, así como tampoco con antígenos de grupo sanguíneo A o B La reactividad del AMC FC-2.15 en los diferentes tejidos FC-2.15 -positivos fue analizada por Western Blot sobre extractos de membrana y caracterizada determinando el efecto de digestiones enzimáticas (con PNGasaF y Neuraminidasa) en la persistencia del Ag. Los resultados obtenidos revelaron que Lewis˟ puede estar formando parte tanto de N-glicoproteínas como de O-mucinas. Según el tipo celular estudiado, Lewis˟ está presente en N-glicoproteínas exclusivamente (bandas de 250, 185 y 105 kDa en muestras de PMN y leucemia), predominantemente en N-glicoproteínas (bandas de 155 y 135 kDa, acompañadas con mucinas de mayor peso molecular, en células de carcinoma de colon T-84) o predominantemente en O-mucinas (células de carcinoma de mama MCF-7).También puede variar la cantidad de lactosaminoglicanos portando sialil Lewis˟, desde la ausencia (MCF-7), pasando por una baja proporción respecto de los Lewis˟-lactosaminoglicanos (PMN) hasta llegar a un gran predominio de los mismos en leucemias y T-84. Puede concluirse, por lo tanto, que PMN normales y diferentes células tumorales pueden expresar residuos Lewis˟ y sialil Lewis˟ en muy diferente proporción y unidos a diferentes proteínas, aunque la relevancia de Lewis˟ en condiciones normales y patológicas tiene que ser aún establecida. En cuanto a las propiedades funcionales del AMC FC-2.15, numerosos experimentos se han realizado en esta Tesis tendientes a caracterizar la interacción del AMC FC-2.15 con PMN y con MCF-7, tanto in vitro como en un sistema ex vivo de circulación sanguínea (SEVCS). Ensayos de aglutinación han demostrado que el AMC FC-2.15 induce la agregación homotípica de PMN in vitro y forma agregados heterotípicos entre PMN y células tumorales Lewis˟-positivas. Ensayos de liberación de [51Cr]han revelado que el AMC FC-2.15 ejerce un fuerte efecto citotóxico sobre los PMN y células MCF-7 por fijación de complemento humano. Posteriormente, con la idea de aproximar a las condiciones en las que el AMC FC-2.15 interacciona in vivo, el ensayo de liberación de [51Cr]fue realizado en sangre entera en circulación en un SEVCS. Contrariamente a lo esperado, el AMC FC-2.15 aglutina, pero no lisa, a los PMN mientras que la lisis de MCF-7 en dicho sistema es prácticamente normal. Estas observaciones permitieron plantear la posibilidad de que en el SEVCS los PMN serían inducidos a agregarse mas rápidamente por la suma de dos mecanismos distintos: el AMC FC-2.15 que activa a los PMN y el flujo aplicado. En la medida que los agregados van siendo formados, habría un impedimento estérico progresivo para el acceso de los factores del sistema de complemento a la porción Fc del AMC FC-2.15 y por ende los grumos de PMN formados no serían lisados. Los experimentos realizados posteriormente validaron esta hipótesis puesto que demostraron que el AMC FC-2.15 no lisa agregados homotípicos de PMN preformados en ensayos in vitro por un lado y que el AMC FC-2.15 es capaz de lisar a los PMN en el SEVCS, cuando la aglutinación de los mismos se impide por pretratamiento con colchicina, por otro. La lisis de MCF-7 en el SEVCS tendría lugar de todas formas debido a su incompleta agregación con los PMN. Puede concluirse entonces que la falta de lisis de los PMN por el AMC FC-2.15 en circulación y, que por el contrario, las células tumorales Lewis˟-positivas sean eficientemente lisadas, son dos caracteristicas importantes que avalan el uso del AMC FC-2.15 en el tratamiento de tumores Lewis˟-positivos, sin riesgo de producir una lisis masiva de los PMN circulantes. Los resultados presentados indican que el AMC FC-2.15 podría ser útil en la inmunoterapia pasiva de pacientes con carcinomas Lewis˟-positivos, sin necesidad de conjugarlo con drogas ni toxinas.

La actividad desarrollada en el campo de las lipasas vegetales es considerablemente menor que la que se lleva a cabo en el de las lipasas de mamíferos y de microorganismos, a pesar de la importancia que tiene el conocimiento de aquéllas, tanto para comprender su rol fisiológico como para analizar su posible aplicación en procesos biotecnológicos. En razón de ello, las semillas de oleaginosas deberían constituir la fuente de elección de lipasas vegetales, dado que los aceites representan su mayor sustrato energético. Por otra parte, su condición de cultivo intensivo asegura una fácil disponibilidad de material de bajo costo y elevada homogeneidad . Como ya ha sido mencionado, el girasol es la principal oleaginosa cultivada en nuestro país, correspondiendo a la Provincia de Buenos Aires más de la mitad de su producción. Sin embargo, más allá de algunos intentos aislados, la información de la que se dispone sobre el sistema lipolítico responsable de la movilización de los lípidos de reserva de esta especie es prácticamente nula, motivos que decidieron la elección del material utilizado en el presente estudio y que persigue los siguientes objetivos específicos: 1. Conocer cómo progresa la degradación de los lípidos de reserva de las semillas de girasol durante la germinación de las mismas y establecer la correlación existente con la gluconeogénesis. 2. Comprobar la existencia de actividad lipolítica en semillas en dormancia y analizar la manifestación de la misma en el curso de la germinación. 3. Determinar la localización subcelular del sistema lipolítico y establecer sus condiciones óptimas de acción in vitro. 4. Estudiar el efecto de iones, detergentes e inhibidores enzimóticos sobre el comportamiento del sistema lipolítico. 5. Establecer si el sistema lipolítico manifiesta alguna especificidad por los triacilglicéridos que componen el aceite y por los ácidos grasos que forman parte de aquéllos.