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Las cuencas hídricas bonaerenses están sometidas sistemáticamente a la acción antrópica, siendo el río Reconquista uno de los más contaminados y de los de mayor importancia por su extensión, caudal y recorrido por zonas de gran densidad poblacional. Mediante bioensayos de exposición con las aguas receptoras y el uso de biota preferentemente nativa, acompañado con la caracterización físico-química del agua, es posible estudiar el impacto que puede sufrir un determinado cuerpo de agua de una manera más realista que mediante el uso de especies validadas por los organismos de regulación internacionales, normalmente del hemisferio Norte. La hipótesis principal es que las aguas de los ríos periurbanos, receptoras de diferentes contaminantes, ejercen efectos adversos sobre la ictiofauna habitante del lugar, siendo Cnesterodon decemmaculatus un modelo de evaluación adecuado. C. decemmaculatus sufre una alteración en un amplio espectro de parámetros de distinta índole que afectan funciones básicas de los individuos y su fitness. El objetivo general es aportar información que contribuya a validar a la especie como organismo modelo para ensayos ecotoxicológicos mediante la caracterización de su respuesta ecofisiológica y ecotoxicológicatemprana, integrando aspectos del metabolismo energético, bioquímicos y biométricos. Considerando la posible estacionalidad de algunos de estos biomarcadores, se pretende establecer una línea de base y caracterizar la respuesta al Cadmio, propuesto como tóxico de referencia. Se realizaron bajo condiciones controladas de laboratorio, cuatro bioensayos semi-estáticos de 12 días de exposición para cada una de las estaciones climáticas (primavera, verano, otoño e invierno), utilizando como medio control negativo agua moderadamente dura -MHW, como control positivo una concentración teórica sub-tóxica de Cadmio -Cd 0.5 mg/l y muestras ambientales provenientes de las nacientes del río Reconquista. Se midió un amplio espectro de biomarcadores de efecto temprano: Biomarcadores biométricos (factor de condición -FC, índice Hepato-somático -IHS, índice Gónado-somático -IGS), Biomarcadores metabólicos (ingesta de alimento -I, producción de heces -H, asimilación del alimento -A, tasa metabólica específica -TME, eficiencia de extracción de oxigeno -EEO, excreción de amonio -E, cociente de amonio -CA y Scope for Growth -SFG) y Biomarcadores bioquímicos (en cerebro, actividad de acetilcolinesterasa -AChE; en hígado, actividad de catalasa -CAT y glutatión-S-transferasa -GST y el contenido de glutatión -GSH). En las aguas receptoras del río se evaluaron diferentes parámetros físico-químicos, metales pesados y plaguicidas, y se calcularon 2 índices de calidad de agua, los que indicaron contaminación leve o nula del ambiente. En algunas de las muestras ambientales se detectó una elevada concentración de cloruros y mayoritariamente Arsénico y Cobre por encima de los límites permitidos para la protección de la biota acuática. El efecto por exposición al agua del río, generó desórdenes en biomarcadores metabólicos (A, TME, EEO, E, CA y SFG) y bioquímicos (AChE, CAT, GST y GSH) principalmente, que demostraron ser parámetros sensibles para la evaluación de ensayos ecotoxicológicos de efecto temprano. Además, el efecto por exposición al Cd se pudo observar en la mayoría de los parámetros registrados, resultando ser, bajo las condiciones de ensayo, un buen control positivo para esta especie. Mediante un análisis de frecuencia se determinaron los biomarcadores con comportamiento estacional, estableciendo una línea de base para animales control en MHW. Por último, a partir de la elección de las variables biológicas seleccionadas, se efectuó la integración de los mismos mediante índices de respuesta de biomarcadores -IBR y el SFG, que se proponen como índices de fitness del animal. La especie test elegida resultó ser apta para la realización de ensayos de impacto ambiental y se propone como modelo biológico para su validación en bioensayos ecotoxicológicos de efecto temprano en estudios de monitoreo ambiental.

Durante el período septiembre 1996 a noviembre 1997, se investigó la evolución de algunos parámetros bióticos y abióticos del río Matanza-Riachuelo (Pcia. de Buenos Aires). Este río atraviesa zonas con diversos usos del suelo, entre ellas, áreas urbanas muy contaminadas. Los muestreos se llevaron a cabo mensualmente en cinco estaciones diferentes. Se estudió la estructura y dinámica del fitoplancton además de las propiedades físicas y químicas del agua. El fitoplancton estuvo dominado por grupos Cyanophyceae, Chlorophyceae (en su mayoría Chlorococcales) y Bacillariophyceae (principalmente diatomeas céntricas), encontrándose las mayores densidades químicas más relevantes fueron los niveles extremadamente bajos de oxígeno disuelto y las elevadas cantidades de nutrientes, materia orgánica y cloruro presentes en el agua. Los metales pesados superaron los niveles guía para la protección de la vida acuática según estándares internacionales y la Ley Nacional de Residuos Peligrosos. Se realizaron bioensayos de inhibición del crecimiento algal con la especie estándar Selenastrum capricornutum Printz (Clase Chlorophyceae, Order Chlorococcales) con el fin de monitorear la calidad del agua y detectar toxicidad por metales pesados con el agregado de un quelante fuerte como el EDTA. En varias muestras, donde las concentraciones de metales fueron muy bajas, se obtuvo inhibición del crecimiento algal, mientras que en otras muestras donde las concentraciones de metales fueron muy altas, no se observó inhibición. Estos resultados indican la presencia de factores mitigantes en el agua tales como sustancias complejantes y la posibilidad de procesos de sinergismo y antagonismo entre los contaminantes presentes en las muesrtas. El único metal que mostró una correlación positiva con los porcentajes de inhibición obtenidos fue el níquel. En una segunda etapa se realizaron bioensayos con cuatro cepas de algas nativas aisladas de este río y pertenecientes a la Clase Chlorophyceae, Orden Chlorococcales. La finalidad de estos estudios fue establecer la resistencia a los metales cobre, cadmio y zinc. La especie más sensible fue Ankistrodesmus fusiformis, mientras que las más resistentes fueron Chlorella ellipsoidea, Scenedesmus acuminatus y Monoraphidium contortum.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

La tuberculosis multirresistente a drogas (MDR-TB) representa un gran desafío sanitario. En el presente trabajo evaluamos en monocitos (Mo) y macrófagos (MΦ), las estrategias de evasión de la respuesta inmune de dos aislados clínicos MDR de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) relacionados genéticamente: la cepa M causante de un extenso brote y la cepa 410 de baja virulencia. Nuestros resultados muestran que: 1) la inducción de citoquinas (CK) y respuesta linfoproliferativa Mtb-específica dependen tanto del status inmunológico del huésped como del genotipo de Mtb, 2) estas diferencias podrían deberse en parte al aumento en el subset de Mo-CD16+ en sangre periférica, 3) la cepa M es pobre inductora de TNF-α tanto en Mo como en MΦ, 4) ambas cepas MDR indujeron una cinética retardada de expresión de IL-1β en Mo, 5) algunos mecanismos de evasión, como la down-regulación del receptor de IFN-γ serían comunes a las cepas estudiadas, 6) la replicación intracelular de la cepa M fue lenta, mientras que 410 se multiplicó rápidamente dentro del MΦ, 7) la infección del MΦ con la cepa 410 induce tempranamente una fuerte secreción de TNF-α e IL-10, 8) la cepa M es capaz de interferir con señales proapoptóticas de la vía intrínseca y probablemente de la vía extrínseca, 9) la cepa 410 indujo predominantemente muerte por necrosis. En base a estos resultados, y a diferencia de lo reportado para otros genotipos virulentos de Mtb, proponemos que el éxito de M se debería a su capacidad de mantenerse en un estado de quiescencia, preservando su nicho y minimizando la respuesta inflamatoria en las etapas tempranas de la infección.

La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a animales de pezuña hendida, como vacunos y porcinos; es causante de epidemias repentinas que acarrrean grandes pérdidas económicas. El control de esta enfermedad se realiza mediante la aplicación regular de vacunas a virus inactivado que son efectivas, pero que poseen el riesgo de re-introducción de la enfermedad debido al manipuleo de grandes cantidades de vian infeccioso o por la inactivación incompleta del antígeno. Este trabajo tiene por objetivos establecer parámetros serológicos que puedan ser útiles para la evaluación del nivel de protección de los animales, y el desarrollo de una estrategia de vacunación alternativa que conjugue seguridad y bajos costos. En primer lugar se evaluó la respuesta imnune humoral y su eventual correlación con el grado de protección contra la fiebre aftosa. Se estableció una correlación entre los niveles de isotipo IgG1 especificos contra VFA y protección. En una segunda parte, se construyeron genes quiméricos codificantes del gen para la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G),una glicoproteína altamente inmunogénica que posee epitopes T funcionales, como carrier del principal sitio antigénico presente en la proteína capsidal VP1 de VFA (ASA), blanco de la respuesta neutralizante. Estos genes quiméricos, uno con la secuencia entera de la G y otro con una deleción de la zona central y 3’, fueron expresados y caracterizados antigénicamente en sistemas libre de células y por transfección de células de mamíferos. Las proteínas quiméricas lograron exponer el epitope elegido en la conformación adecuada, similar sino idéntica a la presente en los viriones. Las construcciones expresadas en el sistema Baculovirus recombinante-céluias de insecto fueron inoculadas i.m. en bovinos en dos dosis de 30 ó 100 μg. La versión delecionada indujo una respuesta humoral con altos niveles de IgG1 y buena actividad neutralizante a los 90 días post vacunación (d.p.v). Se evaluaron las mismas construcciones como vacunas genéticas. Ratones vacunados con ADN codificante para estas quimeras respondieron con un perfil de respuesta Th1, presentando altos niveles de IgG2a. Bovinos vacunados con ADN codificante de la versión delecionada de la quimera, desarrollaron títulos de IgG1 anti VFA específicos tras una sola dosis (15 d.p.v) de 150 μg, pero los niveles de IgG2 prevalecieron a partir de los 45 d.p.v. En este trabajo se propone una estrategia de control de la FA mediante vacunación, combinando la utilización de proteinas recombinantes y ADN a fin de lograr una respuesta protectiva a largo plazo, sin los riesgos asociados a las vacunas a virus inactivado.

El ojo es el órgano que representa la base del sistema de la visión y su complejidad e importancia requieren una protección de magnitud acorde con el órgano mismo. En este sentido, la tolerancia inmune inducida por la mucosa conjuntival es el principal mecanismo de defensa de la superficie ocular, ampliamente estudiado en condiciones de homeostasis. Sin embargo, aún no se había determinado su importancia en el desarrollo de enfermedades. Por esta razón, en este trabajo de tesis, planteamos que la alteración de la tolerancia inmune podría estar favoreciendo la fisiopatología de dos enfermedades diferentes de la superficie ocular.En la primera parte estudiamos la enfermedad de ojo seco, un trastorno autoinmune para el cual los mecanismos iniciadores siguen siendo desconocidos. El estrés de desecación se considera un factor potenciador, y la hiperosmolaridad lagrimal se observa con frecuencia en los pacientes, pero su contribución a la enfermedad no ha sido resuelta. Usando diferentes modelos murinos, encontramos que el estrés de desecación y la película lagrimal hiperosmolar, de forma independiente, causan la pérdida de tolerancia inmune hacia un antígeno exógeno a través de un mecanismo dependiente de la activación epitelial de NF-κB. Además, la inhibición tópica de NF-κB redujo las condiciones proinflamatorias, impidió la alteración de la tolerancia y como consecuencia, mejoraron las condiciones clínicas. Esto destaca que la pérdida de tolerancia de la mucosa juega un rol primordial en la patogénesis del ojo seco y sugiere que la inactivación de NF-κB en la mucosa podría tener potencial terapéutico.En la segunda parte, estudiamos el efecto de una lesión corneal unilateral sobre el comportamiento inmune de la mucosa conjuntival. A partir de un modelo murino, observamos que la tolerancia inmune hacia un antígeno exógeno estaba alterada en el ojo lesionado, pero sorprendentemente, también se alteró en el ojo contralateral sano. Se ha informado la interdependencia inmunológica de los dos ojos para la córnea y la retina, pero no para la mucosa. Reportamos que, ante la falta de drenaje linfático cruzado, existe un arco reflejo neurogénico que comunica ambos ojos. Identificamos a TRPV1 como el receptor que detecta daño tisular en el ojo lesionado y la sustancia P liberada en el ojo contralateral como el efector de la respuesta simpática inflamatoria. Además, el bloqueo del arco reflejo previno las reacciones alérgicas posteriores. Finalmente, concluimos que ambas superficies oculares están inmunológicamente vinculadas y sugerimos potenciales dianas terapéuticas para la intervención.

EI virus de la fiebre aftosa (VFA) pertenece a la familia Picomaviridae y es el agente causal de la fiebre aftosa (FA). Esta enfermedad causa grandes pérdidas económicas en el mundo y se controla mediante vacunación regular con una vacuna a virus inactivado. Esta vacuna presenta desventajas relacionadas principalmente con la manipulación de grandes cantidades de virus vivo y la inactivación incompleta de las preparaciones virales. En este trabajo se evaluó el potencial de vacunas peptídicas representando los sitios antigénicos A y C derivados del VFA serotipo C3 unidos a un epitope para células T derivado del VFA de seotipo O, como alternativa a las vacunas convencionales. Con este fin, se realizaron 5 experimentos de vacunación que involucraron 120 bovinos en total y se estudiaron los efectos de diferentes esquemas de vacunación y distintas dosis de inmunógeno. En cada experimento se evaluó la inducción de anticuerpos neutralizantes, la linfoproliferaciónen respuesta a antígenos virales y la protección frente al desafío con virus homólogo. Los mayores niveles de protección alcanzados fueron del 40% y no fue posible establecer una correlación entre protección y título de anticuerpos neutralizantes o respuesta linfoproliferativa frente a virus entero. En 12 de 29 lesiones rescatadas de los bovinos vacunados con péptidos sintéticos que no resultaron protegidos frente al desafío viral, se aislaron virus mutantes con sustituciones aminoacídicas únicas en la región del sitio A, en posiciones críticas para la antigenicidad del VFA. Las posiciones que se vieron alteradas fueron R (141) —>G incluida en el triplete RGD altamente conservado en los diferentes serotipos de VFA, L (144) —>P y L (147) —>P. Las variantes virales se caracterizaron fenotipicamente en cuanto al tamaño de placa y a su velocidad de crecimiento y antigénicamente mediante ensayos de ELISA y neutralización con un panel de anticuerpos monoclonales secuenciales y conformacionales. Los resultados mostraron que las sustituciones L(144)—P y L(147)-P tienen un efecto muy importante en la antigenicidad del VFA y afectaron múltiples epitopes dentro del sitio antigénico A. La mutación R(141)-G, en cambio, tuvo un efecto menor afectando sólo la reactividad con un AcM. Se discuten las posibles modificaciones en la formulación de las vacunas peptidicas para aumentar su capacidad protectiva y las implicancias de las sustituciones aminoacídicas encontradas en las variantes virales.

Tesis (Doctora en Neurociencias) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018.