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En la presente tesis se abordó la problemática de la contaminación por metales pesados y plaguicidas en arroyos de la Provincia de Santa Fe (Agentina) sobre organismos planctónicos de diferente nivel trófico, así como la eficiencia de acumulación de dichos contaminantes por microalgas a escala de laboratorio

Las células mieloides supresoras (CMS) constituyen una población de células con actividad regulatoria que controla las respuestas inflamatorias crónicas y promueve el escape tumoral. En este proyecto de tesis mostramos que el efecto del antiinflamatorio no esteroide indometacina (Indo) sobre las CMS es dependiente del contexto en el que se diferencie esta población celular. Ratones BALB/c inoculados con el adenocarcinoma de pulmón singeneico LP07 (3x105 células) se trataron in vivo con una dosis de 10 μM de Indo en el agua de beber. El tratamiento inhibió la acumulación de CMS en el tumor y en órganos linfáticos secundarios producida durante la progresión tumoral, inhibió la actividad supresora de las CMS esplénicas sobre la respuesta linfocitaria a un aloantígeno e inhibió el crecimiento tumoral en un ensayo de transferencia adoptiva, p<0.001. En línea con estos resultados, observamos la misma actividad en las CMS cuando se trataron in vitro con Indo (10 μM) en presencia de medio condicionado de células LP07, simulando el microambiente tumoral. Sin embargo, en ausencia del microambiente tumoral, la administración de Indo generó un aumento en la capacidad supresora (MLR; p< 0.05) y pro-tumoral (transferencia adoptiva, p<0.01) de las CMS. Además, las CMS de ratones normales tratadas con Indo en ausencia del microambiente tumoral suprimieron el desarrollo de la encefalomielitis aguda experimental (EAE), un modelo de esclerosis múltiple en ratones C57BL/6, mientras que las CMS tumorales tratadas con Indo aumentaron la severidad de los síntomas e impidieron su resolución (p<0.05). Analizando los mecanismos de inmunosupresión, Indo redujo la actividad arginasa (4,794 vs 2,077 μg urea/ mg total proteína, p<0.001) y la producción de óxido nítrico (9.2 vs 4.4 μM; P<0,05) y de especies reactivas de oxígeno (124 vs 87 MFI P<0.05) en CMS tumorales pero no en CMS normales. Este estudio revela el rol dual de un agente antiinflamatorio en el control de una población celular regulatoria con implicancias críticas en cáncer y en desórdenes autoinmunes.

La exposición ambiental al arsénico es un problema de salud pública debido a que afecta a un gran número de poblaciones del mundo y a que es un agente carcinógeno para humanos. Por tal motivo surge la necesidad del desarrollo de estudios que permitan comprender el modo de acción para poder prevenir los efectos nocivos relacionados con la ingestión de arsenito a través del consumo de agua. El presente trabajo se desarrolló con la finalidad de detectar la influencia de los compuestos arsenicales en posibles procesos cancerosos pre-existentes o simultáneos al consumo del agua con arsenito. Por lo que se diseñaron los experimentos en ratones a los que se les suministr{o arsenito de sodio de manera cr{onica en el agua de bebida. Se tomaron en cuenta distintas dosis (2, 20 o 200 ppm) y distintos momentos de superposición con el proceso clásico de carcinogénesis (antes o después del esquema DMBA/TPA). El efecto del arsenito de sodio en el proceso de carcinogénesis experimental se evidenció en una menor cantidad de tumores en todas las condiciones que bebieron arsenito respecto del control. Pero esas formaciones tumorales evidenciaron una tendencia al aumento del índice de malignidad respecto a los ratones de las condiciones de control. Por otro lado es de destacar que la condición que recibió mayor dosis (200 ppm) bebió un 50% menos que las otras condiciones y que tuvo una tendencia a tener menor peso corporal. Para comprender los efectos sistémicos que puede causar el consumo crónico de arsenio, se estudió ex vivo la población de macrófagos provenientes ya sea de la cavidad peritoneal como del tronco bronqueo-alveolar de dichos ratones. En todos las condiciones la población de macrófagos mantiene la capacidad fisiológica de autorregular su reactividad. Esta característica es más evidente en los macrófagos peritoneales. Por otro lado se observó un aumento sustancial en el número de macrófagos respecto a los ratones que no recibieron ningún tipo de tratamiento. Por último se realizaron estudios in vitro para caracterizar el efecto del arsenito sobre el metabolismo celular tanto de las líneas celulares de estirpe epitelial como de macrófagos alveolares. En los macrófagos alveolares tratados in vitro no se detectaron cambios significativos en la viabilidad celular y en la apoptosis con las concentraciones menores a 2uM para 24-96 hs, pero a concentraciones mayores se observó una marcada disminución en la viabilidad y un significativo aumento de la apoptosis. Para caracterizar el estatus matabólico se estudió la dinámica del proceso de generación de sales de formazona a partir del MTT la cual se modificó a concentraciones mayores a 2uM y por otro lado, se evaluó la actividad específica del MTT tomada como parámetro de actividad metabólica, sin encontrar modificaciones. Pero la actividad específica del NBT como parámetro de generación de anión superóxido se incrementó significativamente. El arsenito modifica el metabolismo y el estatus oxidativo de los macrófagos alveolares in vitro cuando se encuentran en un medio enriquecido con arsenito. En las líneas celulares se estudiaron in vitro los mismos parámetros. En cuanto a la dinámica de generación de formazona así como en la respuesta apoptótica sólo se observaron cambios significativos con conentraciones mayores a 7,5uM. Los resultados obtenidos muestran un resultado paradójico, menos tumores pero mayor malignidad, acorde con las distintas facetas conocidas para éste compuesto, por lo que es necesario hacer hincapié en el tiempo de exposición al mismo, los posibles eventos pre-cancerígenos y la variabilidad interindividual.

El SLPI es un inhibidor de serino proteasas de 11,7 kDa presente en mucosas y con actividad anti-inflamatoria. El objetivo de este trabajo fue esclarecer la función del SLPI en la respuesta inmune. Los resultados obtenidos in vitro muestran que SLPI disminuye la proliferación linfocitaria inducida por IL-2, anti-CD3 y cultivos mixtos linfocitarios en forma dosis dependiente. El SLPI inhibe la activación linfocitaria disminuyendo los niveles de CD25 e inhibiendo la traslocación al núcleo de NF-κB. La inhibición sobre la proliferación no se observa en ausencia células mononucleares de sangre periférica (CMSP) depletadas de monocitos, y fue restituida en presencia de medio condicionado de monocitos pre-tratados con SLPI. Los monocitos tratados con SLPI producen altos niveles de IL-4, IL-6 e IL-10. Además, el SLPI inhibe la producción de IFN-γ y T-bet inducidos por IL-2 y un lisado de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Por otro lado el SLPI disminuye la cantidad de células CD25+/Foxp3+ y la secreción de TGF-β inducida por la elastasa y aumenta los niveles de IL-17 e IL-6. Estos resultados sugieren que el SLPI modula la respuesta inmune adaptativa inhibiendo la diferenciación de las células hacia un patrón Th1, las Treg y favoreciendo el perfil Th2 y Th17. Sin embargo, en modelos murinos in vivo, la administración de SLPI parece tener un efecto anti-inflamatorio; dado que el SLPI fue capaz de limitar las lesiones en la orquitis autoinmune experimental. Este efecto modulador de la respuesta inmune también se pudo corroborar en pruebas de hipersensibilidad retardada y en trasplante de piel. Por otro lado, los niveles de SLPI plasmático y la capacidad linfoproliferativa fue examinada en donantes sanos, pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y pacientes con cáncer de pulmón. Se pudo probar la existencia de una correlación negativa entre la proliferación linfocitaria y los niveles plasmáticos de SLPI para pacientes con EPOC y cáncer de pulmón pero no así para los dadores sanos. Estos resultados muestran al SLPI como una molécula con capacidad inmunomoduladora y los niveles de SLPI plasmáticos podrían ser un índice indirecto de la capacidad linfoproliferativa en los pacientes con EPOC y cáncer de pulmón.

Numerosos estudios epidemiológicos han descrito asociación entre aumentos de mortalidad y morbilidad humana con la existencia de niveles elevados de material particulado (MP) EN EL AIRE. El tamaño y las características físico-químicas del MP se encuentran intimamente relacionados con su origen y con los procesos que lo generaron. El MP proveniente de combustiones antropogénicas, como la generación de energía y la actividad industrial y urbana, presenta una gran proporción de partículas fine (dae < 2.5 μm) y ultrafine (dae 1 μm), mientras que el MP de origen natural presenta una mayor proporción de partículas coarse (dae <10μm). Si bien existen dispositivos de control para reducir las emiciones de MP, éstos son ineficientes para retener partículas mas pequeñas y no se encuentran disponibles en muchas partes de nuestro país. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que los factores pulmonares agudos del CFA (proveniente de la combustión del carbón para la generación de energía eléctrica, con bajo contenido de carbono), se encuentran inversamente relacionados con el tamaño de las partículas y están asociados a un incremento en el contenido de azufre, de cuarzo y de trazas de elementos. Por otra parte, MP obtenidoc luego de un episodio de emisión accidental industrial (coque, proveniente de la combustión de derivados del petróleo, con alto contenido de carbono) generó efectos pulmonares agudos considerables y disminución en las funciones de defensa de macrófagos alveolares. Los efectos del coque crudo son mas pronunciados que los del coque calcinado, indicando una posible participación de los compustos orgánicos adsorbidos en la matriz carbonosa en el primero. La muestra urbana (Ciudad de Buenos Aires) produjo efectos menores que las muestras de coque. Dado que las vías aéreas constituyen la ruta de entrada de los contaminantes del aire al organismo, el conocimiento de los posibles efectos nocivos de los mismos es muy importante para incrementar las medidas de control en ciertas áreas relacionadas con las actividades humanas

La actividad física ha estado presente en la vida diaria del hombre a lo largo del tiempo, modificándose su significancia dependiendo del momento socio-cultural que fue transitando. En las últimas décadas, el ejercicio de baja intensidad ha sido utilizado como uno de los tratamientos más efectivos para prevenir distintas patologías ya que reduce factores de riesgo cardiovasculares y la actividad del sistema nervioso simpático. Sin embargo, no es claro si los efectos benéficos del ejercicio sobre la función cardíaca y al menos algunas de las variables que regulan el remodelamiento ventricular post ejercicio, están relacionados con la intensidad del mismo. Por otro lado, si bien se conoce que durante el ejercicio hay una activación del sistema autónomo simpático, se desconoce si una sobreestimulación de éste modifica las respuestas obtenidas en condiciones normales. Por estos motivos, nuestro objetivo fue estudiar el efecto del ejercicio intenso y moderado sobre la función ventricular basal sistólica y diastólica y su respuesta al estímulo β-adrenérgico, así como también sobre variables histológicas que pueden modificar el remodelamiento ventricular post ejercicio. Para estudiar el efecto de la sobreestimulación simpática, utilizamos un modelo de ratón transgénico con sobreexpresión específica cardíaca de la proteína Gsα, que tiene la característica particular de inducir un estado de hiperactividad simpática, que se traduce en aumento de la frecuencia cardíaca y de la contractilidad. En este estudio, se utilizaron dos líneas de ratones machos de 3 meses de edad, una cepa normal no transgénica (noTG) y otra de ratones transgénicos (TG) con la característica mencionada. Se utilizó un protocolo de natación, por ser un tipo de ejercicio mixto, y fue realizado de forma grupal para generar un nado intenso y constante a lo largo del tiempo de protocolo. Se utilizaron dos intensidades de ejercicio, uno intenso (90 minutos de nado dos veces al día, 6 días a la semana por 4 semanas) y otro moderado (90 minutos de nado una vez al día, 6 días a la semana por 4 semanas). Por lo tanto, se realizaron 6 grupos experimentales: 2 grupos control sedentario (noTG y TG), 2 grupos con ejercicio intenso (noTG y TG) y 2 grupos con ejercicio moderado (noTG y TG). Una vez finalizados los protocolos, se realizó la evaluación de la función ventricular “in vivo” e “in vitro" basal, sistólica y diastólica, como así también de la reserva miocárdica (con isoproterenol). Posteriormente a la eutanasia de los animales, se calcularon los índices de hipertrofia, se realizó el análisis histológico del colágeno intersticial (colorimetría), la densidad capilar (inmunomarcación), el área de los miocitos (fluorescencia) y la expresión de la proteína Akt (western blot). Los resultados obtenidos mostraron que la función ventricular evaluada en condiciones basales estuvo conservada para ambas intensidades de ejercicio. Sin embargo, se observó una importante disminución en los animales noTG con ejercicio intenso, de la reserva miocárdica no sólo inotrópica, sino también cronotrópica y lusitrópica en el ejercicio intenso tanto “in vivo” como “in vitro", a diferencia del moderado, que no tuvo modificaciones significativas respecto al sedentario. Fue interesante observar que la realización del ejercicio intenso en los animales TG con la hiperactividad simpática, atenuó significativamente la alteración deletérea de la reserva miocárdica, sugiriendo un posible efecto benéfico. Desde el punto de vista estructural, no se detectó la presencia de fibrosis en ninguno de los grupos experimentales, mientras que la densidad capilar estuvo significativamente aumentada en los animales con ejercicio moderado, sin modificación significativa con el ejercicio intenso. El área de los miocitos, al igual que los índices de hipertrofia, aumentaron en los dos grupos de ejercicio intenso y se observó levemente aumentado aunque no significativamente en el grupo noTG con ejercicio moderado. Esta variable no se modificó en el grupo de ratones TG. Finalmente, la expresión de la proteína Akt no mostró cambios en ninguno de los 6 grupos experimentales. Por lo menos en nuestro conocimiento, no fue mostrado previamente que el ejercicio intenso puede inducir una marcada reducción de la reserva miocárdica no sólo inotrópica sino también cronotrópica y lusitrópica. Estas limitaciones al aumento no sólo de la contractilidad, sino también al llenado ventricular y al aumento de la frecuencia cardíaca podría limitar severamente la capacidad funcional miocárdica de pacientes que realizan esta intensidad de ejercicio. Por otro lado, también detectamos, que la hiperactividad simpática asociada al ejercicio, podría ser una herramienta útil para atenuar esta disfunción miocárdica. Con los datos obtenidos en el presente estudio no podemos afirmar si la hipertrofia inducida por el ejercicio intenso en nuestras condiciones experimentales es del tipo fisiológica o patológica. La severa disminución de la reserva miocárdica, si bien es compatible con un tipo de hipertrofia no adaptativa o patológica, no alcanza para definir qué tipo de hipertrofia induce esta intensidad de ejercicio, ya que por otro lado, otras variables como la ausencia de fibrosis o la conservación de la densidad capilar, sugieren una hipertrofia adaptativa. La falta de modificación de la proteína Akt, relacionada con la hipertrofia fisiológica, tampoco permite llegar a una conclusión definitiva. Debido a la originalidad de los resultados obtenidos, es importante continuar con las líneas de investigación relacionadas con el ejercicio para esclarecer los interrogantes que surgen del presente estudio. Finalmente, sería interesante continuar la investigación con diversos grupos de mayor cronicidad de ejercicio y de desentrenamiento, buscando la reversibilidad de la hipertrofia y de la disminución de la reserva contráctil encontrada tanto “in vivo” como “in vitro", para determinar la naturaleza de la hipertrofia desarrollada. El campo de investigación en el ejercicio tiene importantes proyecciones debido a estudios recientes en deportistas de alto rendimiento, como así también en la sobrevida de enfermedades cardiovasculares y del sedentarismo.

Existen dos zonas neurogénicas en el cerebro adulto. Una es la zona subventricular que da origen a interneuronas del bulbo olfatorio y otra es la zona subgranular del giro dentado del hipocampo que genera células granulares (CGs). Las CGs nacidas en animales jóvenes se desarrollan y maduran por varias semanas, durante las cuales establecen conexiones funcionales aferentes y eferentes, adquiriendo la capacidad de procesar información. Para estudiar de qué manera este proceso es alterado por la edad se marcaron células progenitoras neurales (CPNs) de ratones de distintas edades con la proteína fluorescente verde y se analizó su morfología a distintos tiempos post-inyección, obteniéndose así las curvas de maduración para neuronas nacidas en en distintos momentos. A partir de este análisis se pudo observar que a medida que avanza la edad, la tasa de maduración se ralentiza, notándose un mayor efecto en las primeras semanas del desarrollo de estas neuronas. A medida que el ratón envejece presenta niveles decrecientes de actividad basal del giro dentado que correlaciona con un desarrollo neuronal más lento. A pesar de dicho retraso, experimentos de electrofisiología demostraron que estas neuronas son capaces de integrar un estímulo excitatorio y disparar potenciales de acción de modo comparable a la de neuronas nacidas en el animal adulto joven. Para comprender las bases del efecto del envejecimiento en el desarrollo neuronal se plantearon diversas manipulaciones experimentales para modular su tasa de maduración. En primer lugar se sometió a los ratones envejecidos a ejercicio voluntario y se observó que este tratamiento aceleró la maduración neuronal en animales envejecidos, con efectos más dramáticos en animales más viejos. Los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se encuentran disminuidos en hipocampos de animales envejecidos, y los hipocampos de ratones corredores presentan mayores niveles de BDNF comparados con los sedentarios, indicando un posible efecto de este factor neurotrófico en el desarrollo neuronal de ratones envejecidos que realizan ejercicio físico. Para determinar si un efecto de aceleración de la maduración puede estar relacionado con la propia actividad eléctrica de las neuronas en desarrollo, se utilizó la transducción retroviral de receptores sintéticos acoplados a proteína G para activarlas en forma intrínseca. Esta manipulación también revirtió el efecto provocado por el envejecimiento. Para investigar el rol del BDNF en el desarrollo neuronal de animales envejecidos se utilizó la técnica de ARN de interferencia (short hairpin ARN) para Lrig1, un modulador negativo de la vía de BDNF. Se observó un aumento en el efecto dendritogénico en las CGs que sobreexpresan el shLrig1 en animales envejecidos. Esto sugiere un rol clave de la vía del BDNF en el desarrollo neuronal. Estos resultados demuestran que tanto la actividad del nicho neurogénico como la propia actividad de la célula cumplen un rol crucial en la tasa de maduración de las CGs. Palabras claves: Envejecimiento, neurogénesis adulta, desarrollo neuronal, plasticidad neuronal, ejercicio voluntario, actividad neuronal, BDNF.

A medida que envejece, el cerebro de los mamíferos sufre modificaciones bioquímicas, estructurales y funcionales que disminuyen la plasticidad de sus circuitos. Estos cambios han sido propuestos como responsables del déficit cognitivo y del aumento en la incidencia de las enfermedades neurodegenerativas que se presentan con la edad. El giro dentado del hipocampo cuenta con una forma de plasticidad singular dada por la producción de nuevas neuronas granulares a lo largo de toda la vida. Mediante transducción retroviral con proteínas reporteras y/o transgenes relacionados con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer se logró utilizar a estas neuronas como vehículo para monitorear los efectos del envejecimiento normal y patológico sobre la plasticidad neuronal. Utilizando inmunofluorescencia y microscopía confocal en ratones wild type envejecidos y en transgénicos modelando la enfermedad de Alzheimer pudimos observar que, aunque el número de neuronas generadas disminuye a lo largo de la vida, estas no se ven afectadas en su migración ni en la densidad de los contactos sinápticos aferentes que desarrollan durante el envejecimiento normal o patológico. Por otro lado, combinando registros electrofisiológicos con análisis morfológico encontramos que la expresión autónoma de célula de diferentes variedades de la proteína precursora de amiloide (APP) altera transitoriamente la forma en que estas neuronas se conectan al circuito del giro dentado. Llamativamente, este efecto parecería no estar mediado por el péptido β amiloide, sino por algún dominio contenido en el extremo C-terminal de APP. En conjunto estos resultados estarían indicando que a pesar de la diversidad de los cambios que se presentan en el cerebro durante el envejecimiento y la neurodegeneración, las neuronas granulares que se desarrollan en el giro dentado bajo tales circunstancias pueden incorporarse anatómica y funcionalmente al circuito. Sin embargo, la dinámica con que se da esta integración se ve afectada por la sobreexpresión de APP en forma autónoma de célula. Alteraciones sutiles como esta podrían subyacer a las manifestaciones cognitivas iniciales encontradas en la enfermedad de Alzheimer.