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Los tumores neuroendocrinos (TNE) comprenden un grupo heterogéneo de neoplasias malignas que presentan una amplia gama de características morfológicas, funcionales y comportamentales. El concepto de diferenciación neuroendocrina (NE) puede definirse como la secreción de sustancias bioactivas por las células neoplásicas. El crecimiento de TNE está regulado principalmente por señalización autócrina y parácrina a través de neuropéptidos, hormonas peptídicas y bioaminas con acciones fisiológicas definidas, estas vías de señalización dependen de la expresión de receptores específicos en las células tumorales. Las principales proteínas expresadas por estos tumores son la sinaptofisina, la cromogranina A (CgA) y la enolasa neuronal específica (NSE), entre otras. La CgA es el biomarcador más utilizado para detectar la diferenciación NE en el cáncer de próstata ya sea a nivel tisular o en la circulación general. La NSE es actualmente el marcador tumoral más confiable en el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). La diferenciación NE de los tumores ha sido relacionada con la transición de las células cancerosas con características epiteliales hacia células con fenotipos invasivos y metastásicos (transición epitelio mensenquimal, TEM). En algunos tipos de cáncer, como el cáncer de próstata, también se ha vinculado la diferenciación NE con la transición de un tumor hormono dependiente hacia un tumor hormono-independiente contribuyendo esta transdiferenciación con la progresión tumoral, la resistencia hormonal y con un pronóstico desfavorable. Además, en cáncer de pulmón, la transformación de nSCLC a SCLC se asocia con mala respuesta al tratamiento y aumento de NSE en suero. Una reducción de la expresión de los marcadores NE podría indicar desdiferenciación NE. La vasopresina (AVP) es un neuropéptido con efecto endócrino, parácrino y autócrino en tejidos normales y patológicos. Los receptores AVP están presentes en diferentes tipos de cáncer, como cáncer de pulmón, de mama, pancreático, colorrecal y gastrointentinal, con efectos contrastantes sobre el crecimiento tumoral dependiendo del subtipo del receptor. Mientras que los receptores de AVP de tipo 1 (V1a y V1b) están asociados con la estimulación de la proliferación celular, el receptor de AVP de tipo 2 (V2r) está relacionado con efectos antiproliferativos. La desmopresina (dDAVP) es un análogo sintético de AVP que actúa como un agonista selectivo para el V2r, que ha mostrado propiedades antitumorales en modelos de cáncer de mama y colorrectal.El desarrollo de medicamentos cada vez más seguros, adecuados y eficaces para el tratamiento de enfermedades es una tarea que requiere la interacción de diferentes disciplinas. La identificación de secuencias de péptidos y el análisis de fuentes naturales es un enfoque ampliamente utilizado basado en una perspectiva evolutiva para la búsqueda de nuevos compuestos con aplicaciones terapéuticas. Por otra parte, el diseño racional de los fármacos basados en estudios de relaciones de estructura-actividad (SAR), constituye una herramienta indispensable en el desarrollo de nuevos medicamentos. El objetivo de la presente tesis doctoral fue desarrollar análogos de AVP diseñados mediante una aproximación racional y una evolutiva, y evaluar las propiedades antitumorales in vitro e in vivo de los análogos de AVP diseñados sobre líneas celulares con y sin características NE, incluyendo las siguientes líneas celulares: NCI-H82, agresiva de SCLC, NCI-H125, NSCLC (carcinoma escamoso de pulmón) y PC-3, cáncer de próstata.El primer método de diseño de fármacos utilizado consistió en aplicar un enfoque evolutivo explorando péptidos bioactivos de fuentes naturales, prestando especial atención a su actividad fisiológica específica. Esta estrategia basada en la evolución nos llevó a diseñar un nuevo análogo derivatizado a partir del péptido INT presente en escarabajos, denominado dDINT. El segundo enfoque explorado se basó en la realización de un estudio SAR utilizando la técnica de Ala-scanning sobre dDAVP como compuesto de primera generación para identificar las posiciones aminoacídicas claves implicadas en su actividad antiproliferativa sobre las células NCI-H82. Previamente a ésta exploración se identificó el blanco molecular V2r y la expresión de los marcadores NE, CgA y NSE, en las líneas estudiadas mostrando que las líneas NCI-H82 y PC-3 presentan V2r y expresan los marcadores NE, la línea NCI-H82 mostró un mayor expresión tanto del receptor como de los marcadores NE por lo que fue elegida para el ala scanning. Después de evaluar todos los derivados de dDAVP sustituidos con Ala, se demostró una estrecha relación entre la secuencia aminoacídica que pertenece al bucle conformacional de dDAVP y su actividad antiproliferativa. Como resultado, sintetizamos el nuevo análogo selectivo, [V4Q5] dDAVP, introduciendo valina y glutamina en las posiciones aminoacídicas 4 y 5, respectivamente. [V4Q5] dDAVP mostró interesantes efectos biológicos, mostrando un aumento de los efectos citostáticos en las células tumorales de SCLC en comparación con el compuesto parental dDAVP, así como también comparado con el análogo dDINT. Los análogos de AVP, dDAVP y [V4Q5] dDAVP, fueron evaluados preclínicamente in vitro, donde redujeron significativamente la proliferación, el tiempo de duplicación y la migración en ambos cultivos de células tumorales, NCI-H82 y PC-3 positivas para V2r. No tuvieron efecto sobre la línea celular que no presenta características NE y no expresa V2r NCI-H125. Ambos análogos tuvieron, además, un efecto que conduciría a una regulación pro-apoptótica de las células tumorales al regular la expresión de BAX y su par anti-apoptótico: Bcl-2 o Bcl-xL en las líneas de próstata y pulmón respectivamente. El análogo de segunda generación [V4Q5] dDAVP mostró un mayor efecto citostático que dDAVP sobre la proliferación celular en la línea celular NCI-H82. El silenciamiento de V2r usando ARN de interferencia atenuó significativamente los efectos inhibitorios de [V4Q5] dDAVP sobre la proliferación de células NCI-H82 así como también el bloqueo del receptor mediante un antagonista competitivo no peptídico mostró el mismo efecto, confirmando así que el nuevo análogo actúa principalmente vía V2r. Curiosamente, después del tratamiento con dDAVP, la expresión de ambos marcadores NE estudiados, CgA y NSE, se redujo en las líneas celulares de cáncer de pulmón y de próstata. En los pacientes con cáncer, los niveles elevados de CgA y NSE se correlacionan con carga tumoral, número de sitios de diseminación y falta de respuesta clínica, mientras que una disminución de estos biomarcadores podría indicar un mejor pronóstico. La capacidad de dDAVP para modular los marcadores NE en diferentes tipos de tumores constituye una contribución interesante e importante para estudios posteriores.Exploramos el efecto in vivo de dDAVP y [V4Q5] dDAVP en xenoinjertos de SCLC NCI-H82 y de carcinoma prostático agresivoPC-3. Los tumores tratados (0.3 μg/kg/día, tres veces por semana) crecieron más lentamente en comparación con los animales tratados con el vehículo en ambos modelos. También se observó una disminución de la angiogénesis in vivo en los tumores de SCLC tratados con dosis de 1 µg/kg/día de ambos análogos, mostrando de este modo el efecto antiangiogénico del compuesto. Tanto NCI-H82 como PC-3, representan modelos tumorales NE de resistencia a las terapias y enfermedad recurrente muy valiosos.Resumiendo, en esta tesis, hemos demostrado que el diseño racional basado en SAR es una buena herramienta para el diseño de agonistas específicos de V2r. Si bien el abordaje evolutivo en este trabajo no arrojó un análogo con propiedades antitumorales mejoradas, los abordajes evolutivos en combinación con estudios de SAR y estudios computacionales podrían proporcionar la base para futuros estudios de neuropéptidos para el desarrollo de nuevos y mejores análogos con potencial aplicación terapéutica, así como también, la reinterpretación fisiológica en humanos a partir del estudio evolutivo y la actividad fisiológica en otros animales podría contribuir al entendimiento de la enfermedad.Dada la agresividad de la enfermedad y la urgente necesidad de nuevos enfoques terapéuticos, los estudios realizados y los resultados obtenidos en esta tesis doctoral, en el modelo de SCLC humano: NCI-H82, y en el modelo de cáncer de próstata con rasgos NE: PC-3, constituyen el puntapié inicial para el desarrollo preclínico de éstos análogos de AVP, agonistas de V2r en éstos tipos de cáncer, representando hallazgos que no sólo contribuyen a la búsqueda de posibles terapias para TNE, sino que también, arrojan valiosos modelos de enfermedad de alta recurrencia y resistencia a fármacos.

Los progenitores endoteliales poseen un enorme potencial terapéutico debido a su papel crucial en la formación de vasos sanguíneos de novo, a través de un proceso denominado vasculogénesis. Entre ellos, las células formadoras de colonias endoteliales (CFCE) poseen todas las características de un verdadero progenitor endotelial y son capaces de formar nuevos vasos in vivo. Aun así, teniendo en cuenta la limitada disponibilidad de progenitores endoteliales en sangre periférica y el hecho de que en pacientes con riesgo cardiovascular el número y/o función de los progenitores endoteliales se encuentran enormemente reducidos, en la actualidad se impulsa el desarrollo de nuevas estrategias para optimizar la expansión y diferenciación de estos progenitores ex vivo y por ende los resultados terapéuticos con fines regenerativos.Una característica común a diversas condiciones patológicas donde la formación de nuevos vasos ocurre activamente, como la isquemia, el daño tisular por traumas, quemaduras u otras heridas, es la presencia de un microambiente inflamatorio ácido. Previamente demostramos que la acidosis induce apoptosis de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+). Considerando que las CFCE son una subpoblación de las células CD34+ y que tienen un papel clave en la vasculogénesis, nuestro objetivo fue investigar el efecto de la acidosis en la sobrevida y funcionalidad de estos progenitores.Las CFCE fueron obtenidas por diferenciación de células CD34+ humanas de sangre del cordón umbilical o de sangre periférica en un medio de crecimiento endotelial EGM2 durante 14-18 días. El medio de cultivo fue acidificado por adición de un volumen precalculado de HCl isotónico (1N) y el preacondicionamiento se logró mediante la exposición de los progenitores a EGM2 ajustado a pH 7.4, 7.0 y 6.6, que luego fue reemplazado por EGM2 fresco ajustado a pH fisiológico (7.4).Nuestros resultados mostraron que la acidosis no indujo apoptosis de las CFCE y, aunque inicialmente se observó una reducción en sus funciones, una vez que el pH fue restaurado a valores de 7.4, varias respuestas angiogénicas de las CFCE aumentaron significativamente. Este procedimiento, conocido como preacondicionamiento ácido, ejerció un efecto proangiogénico máximo a las 6 horas de exposición a pH 6.6. In vitro, mejoró significativamente la proliferación de las CFCE, su adhesión a células endoteliales activadas y a componentes de la matriz extracelular, la quimiotaxis mediada por SDF1 y la formación de túbulos. In vivo, incrementó su capacidad regenerativa en un modelo de isquemia de miembro inferior, disminuyendo el grado de inflamación local y aumentando el número de vasos sanguíneos en el músculo gastrocnemio. El efecto proangiogénico del preacondicionamiento ácido fue similar en progenitores endoteliales tardíos derivados de sangre periférica, sugiriendo que esta estrategia es efectiva en células adultas que pueden ser utilizadas en trasplantes autólogos. Por otro lado, los beneficios del preacondicionamiento ácido no fueron observados en células endoteliales maduras de micro y macrovasculatura.Los mecanismos involucrados en el efecto proangiogénico de la acidosis incluyeron la activación de las vías de señalización AKT y ERK1/2 y la inhibición de la quinasa p38. Más aun, la supresión farmacológica de ERK1/2 y AKT suprimió el aumento en la proliferación inducido por el pH ácido, mientras que el inhibidor de p38 incrementó la tubulogénesis a pH 7.4 y potenció el incremento observado a pH 6.6. En cuanto a la adhesión celular, la quinasa de adhesión focal (FAK) se encontró activada en las CFCE preacondicionadas.Además, demostramos que el preacondicionamiento ácido es una estrategia efectiva en condiciones de estrés e inflamación, ya que protegió a los CFCE de la acción citotóxica de moléculas elevadas en el microambiente inflamatorio isquémico como los cristales de urato monosódico, las histonas extracelulares y el TNFα, así como también del efecto antiangiogénico del TNFα en condiciones normales y de alta glucosa.En conclusión, en el presente trabajo de tesis demostramos que el preacondicionamiento ácido representa una estrategia efectiva para optimizar la expansión ex vivo de CFCE, las cuales resultan más resistentes a condiciones adversas, típicamente presentes en pacientes con enfermedades cardiovasculares como la inflamación y la alta glucosa, y con un mayor potencial terapéutico.

El consumo de sustancias psicoactivas durante el embarazo aumenta el riesgo de desarrollo de un amplio espectro de enfermedades asociadas al período perinatal y que, en algunos casos, acompañarán al neonato de por vida. Si bien los efectos que los psicofármacos tienen sobre el sistema nervioso son objeto de un amplio campo de estudio, el mecanismo de acción y posibles efectos que estas sustancias producen sobre otros tejidos son menos difundidos. El objetivo general de este trabajo de tesis fue estudiar el efecto de drogas psicoactivas, en particular el etanol de consumo masivo, y la risperidona utilizada en el tratamiento de la psicosis, sobre las propiedades contráctiles del músculo liso vascular humano. Utilizamos para ello la arteria umbilical, vaso de fundamental importancia en la regulación del flujo fetoplacentario durante el período de gestación. Los objetivos particulares abordaron 1. el estudio “in vitro”de los efectos agudos que el etanol y la risperidona producen sobre la arteria umbilical profundizando sobre sus mecanismos de acción en la célula de músculo liso; 2. el análisis de las propiedades contráctiles de las arterias umbilicales de los neonatos expuestos al etanol durante su gestación; 3. la valoración del estado de salud y la presencia de malformaciones relacionadas con el síndrome alcohólico fetal en neonatos de madres consumidoras de bebidas alcohólicas durante la gestación.

Antecedentes: Dentro de los factores de riesgo cardiovascular (FRCV), la hipercolesterolemia es considerada la causa más frecuente de enfermedad coronaria y da inicio a un proceso de disfunción vascular caracterizado por alteraciones estructurales y funcionales que incluyen en su génesis estrés oxidativo y procesos inflamatorios. Estudios clínicos recientes evidencian que algunos compuestos fitoterápicos mejorarían los procesos fisiopatológicos de la hipercolesterolemia. En este sentido, se ha demostrado que los flavonoides tienen efectos benéficos sobre la función vascular por sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. En estudios previos desarrollamos un modelo experimental de hipercolesterolemia inducida por una dieta rica en colesterol al 1% (DH) caracterizado por disfunción endotelial e incremento de la respuesta contráctil a angiotensina II (Ang II) inducida por la liberación de metabolitos vasoconstrictores, proceso mediado por la enzima ciclooxigenasa (COX). Asimismo, se ha demostrado in vitro que Zuccagnia punctata (Zp), especie endémica argentina rica en flavonoides, tiene un efecto antioxidante y antiinflamatorio inhibidor de la COX. Teniendo en cuenta estos antecedentes el objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de un extracto estandarizado de Zp (ZpE) y productos fitoterápicos presentes en el mismo sobre la función vascular en un modelo de conejo con hipercolesterolemia. Metodología y Resultados: A) Se elaboró un extracto hidroalcohólico (ZpE) a partir las partes aéreas de Zp (hojas y tallos) y se lo estandarizó químicamente. Los principales flavonoides presentes en ZpE fueron: 2´,4´,-dihidroxichalcona (DHC), 2´,4´-dihidroxi-3´-metoxichalcona (DHMC), 7-hidroxiflavanona (HF), y 3,7-dihidroxiflavona (DHF). Se caracterizó el efecto in vitro del ZpE y sus principales flavonoides sobre la reactividad vascular en arterias de conejos alimentados con dieta control (DC) y DH durante 6 semanas. Se observó: efecto vasorelajante del ZpE y sus principales flavonoides (DHC, HF y DHF) dependiente de la concentración, efecto sobre la relajación a acetilcolina (Ach) en arterias de animales con DH que depende del compuesto estudiado y su concentración (DHC 10−5 M mejora la relajación máxima, mientras que todas las concentraciones del ZpE y HF y las concentraciones más bajas de DHC y DHF mejoran la sensibilidad a la Ach), efecto inhibidor de la respuesta contráctil a Ang II en el grupo DH (concentraciones altas del ZpE, DHC y DHF actúan como antagonistas no competitivos, mientras que concentraciones bajas se comportan como antagonistas competitivos). B) Se caracterizó el efecto in vivo de la administración oral de ZpE. Se realizó un estudio de dosis efectiva en animales alimentados con DC (2,5 - 5 - 10 mg EAG/día). Se seleccionó la dosis de 2,5 mg EAG/día y se administró a animales con DH. Se observó: disminución en los niveles plasmáticos de colesterol, triglicéridos, presión arterial media, glutamato-oxalacetato transaminasa y bilirrubina; mejora en los parámetros de estrés oxidativo, hematocrito, número de leucocitos, alteraciones histológicas (relación íntima/media y el área sudanofílica) y de la función endotelial (aumento de la respuesta relajante a la Ach) y la función vascular (reducción de la respuesta contráctil a Ang II y noradrenalina). Conclusión: El ZpE rico en flavonoides tiene efectos benéficos sobre la función vascular a través de mecanismos vasodilatadores y antagonistas de la Ang II, sumado a su propiedad hipocolesterolémica cuando es administrado oralmente. Estos hallazgos validan científicamente el uso del ZpE como producto fitoterápico para la prevención de FRCV relacionados con la hipercolesterolemia y la disfunción endotelial.

El objetivo general de la presente tesis es implementar una terapia génica pituitaria neonatal mediante el vector adenoviral portador del gen sintético para timulina (RAd- FTS), con el fin de prevenir deficiencias en las poblaciones adenohipofisarias, en los niveles séricos de la timulina y de las hormonas hipofisarias de ratones nude