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Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst es un hongo causante de pudrición blanca y por consiguiente es capaz de degradar la lignina de la madera y otros sustratos sobre los que crece. Se evaluó su capacidad de producir las enzimas ligninolíticas Lacasa, Manganeso peroxidasa y lignin peroxidasa, encontrándose que sólo la lacasa se produce con una actividad apreciable. Se evaluó la inducción con metales pesados y compuestos fenólicos y se determinó que entre las sustancias ensayadas, el cobre y el ácido ferúlico son los mejores inductores de la lacasa. Se evaluaron fuentes de carbono y nitrógeno a fines de proponer un medio consistente en glucosa, peptona, extracto de levadura, cobre ya ácido ferúlico óptimo para la producción de esta enzima y a través de diseños factoriales se obtuvieron optimizaron las concentraciones de los mismos. Se encontró además que los dos tipos de inductores (fenólicos y metálicos) producen distintos patrones electroforéticos de actividad lacasa. Se optimizó la producción de cuerpos fructíferos en medios basados en aserrín de pino y álamo con y sin chips de esas maderas, concluyendo que la mayor bioconversión (peso seco de fructificaciones / peso seco de sustrato) se encuentra sobre aserrín de álamo con chips. Se evaluaron los componentes de los sustratos nuevos y gastados así como también los de la fructificación para caracterizar la bioconversión y se cuantificaron las actividades enzimáticas ligninolíticas e hidrolíticas. Se estudió la degradación de colorantes industriales por medios líquidos y sólidos y se evaluó el efecto de los mediadores de oxidorreducción HBT y ABTS. Se encontró que los compuestos fenólicos vainilloides producen un efecto protector sobre el micelio contra distintos xenobióticos por vías distintas de la inducción enzimática y se concluyó que el mecanismo consiste en la alteración de la matriz extracelular del micelio incrementando su capacidad para retener los tóxicos.

Los hongos causantes de pudrición blanca, producen enzimas lignolíticas, inespecíficas y altamente oxidativas, con capacidad para degradar distintos contaminantes. Los compuestos fenólicos son un grupo de moléculas orgánicas cuyo uso masivo industrial condujo a la contaminación de ecosistemas acuáticos y terrestres, resultando en su clasificación como contaminantes prioritarios. En el presente trabajo se realizó un relevamiento de cepas nativas de hongos de pudrición blanca en búsqueda de microorganismos capaces de ser empleados en la degradación y detoxificación de fenoles y derivados. Como resultado de dicho relevamiento se seleccionó a Trametes versicolor BAFC 2234 por su capacidad para degradar distintos compuestos fenólicos (fenol, ácido gálico, 2,6 dimetoxifenol y guayacol) y por su habilidad para utilizar el fenol como única fuente de carbono. Se analizó el secretoma de T. versicolor creciendo en medio de cultivo natural jugo de tomate suplementado con cobre y manganeso empleando el enfoque proteómico. Se identificó un número considerable de las proteínas relacionadas con la degradación de la biomasa lignocelulósica y entre éstas, hidrolasas, peroxidasas y oxidasas fueron las enzimas más abundantes. Se purificaron diversas enzimas lignolíticas: una polifenol oxidasa (lacasa), tres Mn-peroxidasas y una versatil peroxidasa. Esta última enzima no había sido purificada previamente en esta especie. Se detectó también por primera vez presencia de peroxidasa decolorante de tintes en T. versicolor. Cultivos de T. versicolor removieron eficientemente fenol y nitrofenol, pudieron también decolorar el tinte Azure B y el licor negro, residuo proveniente de la producción de papel. T. versicolor removió el 71, 62, 74 y 73% del fenol 15 mM adicionado en tres ciclos repetidos en un periodo de 23 días, inmovilizado en esponja vegetal (Luffa aegyptiaca). El hongo inmovilizado removió el 97% del 4- nitrofenol (1 mM) luego de 3 días. Esta cepa además disminuyó la fitotoxicidad de las respectivas muestras tratadas. Se investigó la transformación del fenol por acción de sus enzimas purificadas lacasa y Mn-peroxidasa; y la del 2-, 3- y 4-nitrofenol adicionalmente por la enzima versatil peroxidasa. El hongo produjo lacasa como principal enzima lignolítica, pero esta enzima purificada no fue capaz de degradar el nitrofenol. Mn-peroxidasa y versatil peroxidasa degradaron 2- y 4-nitrofenol in vitro en porcentajes cercanos al 50%. La lacasa de T. versicolor removió 84% del fenol en 4 hs, mientras que un 43% fue removido por la Mn-peroxidasa. Tanto el estudio del secretoma de esta cepa como los ensayos de degradación in vivo e in vitro llevados a cabo, aportan información valiosa sobre el potencial empleo de esta cepa de T. versicolor en la biorremediación de efluentes industriales.

En esta Tesis se presenta un bioensayo microbiano amperométrico para la determinación rápida de BOD (demanda bioquímica de oxígeno) en muestras de agua basado en la utilización de ferricianuro como aceptor de electrones del metabolismo bacteriano. Se logró simplificar la metodología generalmente utilizada en este tipo de bioensayos y el rango lineal obtenido representa una gran mejora frente al rango lineal que presenta el ensayo BOD5. Mediante este bioensayo se determinó la BOD de varias muestras de agua obteniéndose una buena correlación con los resultados del test BOD5 y un RSD ≤ 10%. De manera de diseñar un sistema portátil a partir de este bioensayo amperométrico, se obtuvieron cultivos liofilizados de K. pneumoniae metabólicamente activos, hasta 35 días después de realizar la liofilización y se estudió la posibilidad de utilizar electrodos de tinta de Au descartables realizados por screen-printing, en ensayos de convección forzada. Otra alternativa analizada para la determinación rápida de BOD de muestras reales fue el desarrollo de un biosensor potenciométrico basado en el empleo de un electrodo potenciométrico sensible a CO2 y la inmovilización en membrana de distintos microorganismos. Este biosensor también permitió determinar la BOD de muestras de agua reales obteniéndose una buena correlación con los resultados del test BOD5. Como último trabajo de esta Tesis, se desarrolló un bioensayo para la determinación de toxicidad aguda de nanopartículas de Ag, basado en la técnica de espectroscopía de impedancia electroquímica, empleando electrodos interdigitados de Au y células NHDF (normal human dermal fibroblasts) como material biológico. Este trabajo se realizó en parte en el Austrian Institute of Technology (AIT) bajo la dirección del Dr. Peter Ertl.

La capacidad de diversos microorganismos para biodegradar hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH) se ha estudiado ampliamente durante las últimas décadas para hacer frente a la extensa contaminación del medio ambiente. No siempre es posible combinar en un único organismo todas las características necesarias para resolver un problema ambiental determinado. Bajo estas circunstancias, una estrategia adecuada es la generación de cultivos microbianos mixtos que combinan actividades enzimáticas degradadoras inherentes a los miembros individuales, sin embargo poco se sabe acerca de los mecanismos que intervienen en la cooperación mutua microbiana. La integración de la genómica, transcriptómica y los estudios fisiológicos en ecología microbiana permite observar el potencial metabólico de comunidades degradadoras de PAH, lo que es crucial para recrear y acelerar los procesos naturales así como para llevar a cabo su manipulación racional. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de estrategias biotecnológicas que permitan optimizar los procesos de biorremediación de suelos crónicamente contaminados con PAH y producir un aporte a los conocimientos relacionados con la ecología microbiana de consorcios bacterianos degradadores de PAH se diseñaron consorcios bacterianos que muestren una alta eficiencia de degradación de PAH. En primer lugar, se estudió la efectividad de un consorcio bacteriano (CON), obtenido de un suelo crónicamente contaminado con PAH, para degradar hidrocarburos y los cambios producidos en su estructura y composición cuando este se inocula con una cepa competitiva (Sphingomonas paucimobilis 20006FA). Se estudió la diversidad, estructura y funcionalidad del consorcio inoculado (CON-I) durante la degradación de fenantreno en medio líquido por métodos clásicos y moleculares. Además, se profundizó el estudio de la cepa 20006FA mediante ensayos de degradación de PAH y análisis ómicos. Se evaluó la capacidad de degradar fenantreno en distintas concentraciones y diferentes PAH, junto a los metabolitos generados durante el proceso de degradación. Se estudió el genoma para identificar genes de la vía de degradación de fenantreno y posibles reguladores de las vías de degradación de PAH. Mediante geles 2-DE, se analizó el proteoma a diferentes tiempos de la degradación de fenantreno y se integraron estos resultados para mostrar una ruta de degradación de fenantreno propuesta para 20006FA. En segundo lugar, este trabajo de tesis tuvo como objetivo diseñar consorcios sintéticos combinando todas las cepas aisladas a partir del consorcio natural CON, con el fin de establecer la contribución de cada población al proceso de degradación de fenantreno y estudiar su potencial para ser utilizados como inoculantes en procesos de biorremediación. A través del uso de herramientas genómicas, se abordó el estudio del rol que cumple cada población bacteriana presente en los consorcios durante la degradación de PAH mediante la búsqueda de enzimas vinculadas a la degradación y se incursionó en la aplicación de estrategias transcriptómicas para evaluar la expresión de genes catabólicos y la respuesta funcional frente a la degradación de fenantreno en medio líquido de las cepas que conforman los consorcios más eficientes. Los métodos computacionales han sido esenciales para aprovechar los datos y obtener ideas claras de cómo estos consorcios funcionan. A partir de los datos de secuenciación de ADN de las cepas aisladas y los datos filogenéticos, se realizó la reconstrucción automática de redes de biodegradación. El trabajo de tesis nos permitió elucidar la vía metabólica de degradación de fenantreno en S. paucimobilis 20006FA usando una combinación de genómica y proteómica, cuyos resultados fueron verificados por estudios fisiológicos. La inoculación de una cepa degradadora logró aumentar el potencial degradador del consorcio natural CON y mejorar la eficiencia de degradación, sin la acumulación de productos intermediarios tóxicos. A través de los estudios con técnicas de secuenciación de alto rendimiento se logró conocer la estructura de los consorcios y que la inoculación produjo una disminución de la diversidad con respecto a CON. Mediante la construcción de una red metabólica específica de la degradación de fenantreno, se predijo in silico cuáles son las poblaciones responsables del ataque inicial al fenantreno y cuáles intervendrían posteriormente. La aplicación de RT-qPCR para evaluar la expresión de genes catabólicos de la degradación de fenantreno indicó que cepas participarían de los primeros pasos de la degradación de fenantreno. A partir de los estudios funcionales de cepas aisladas y las herramientas ómicas, se generaron consorcios bacterianos sintróficos que mostraron una alta eficiencia de degradación de PAH. Los consorcios obtenidos podrían ser utilizados como inoculantes para favorecer la biorremediación de suelos contaminados con PAH. Esto resulta una ventaja tecnológica, ya que los ensambles microbianos sintéticos se pueden propagar con mayor facilidad que los consorcios naturales, bajo condiciones experimentales. Se logró dar un primer paso en el estudio de las interacciones entre las poblaciones de un consorcio natural y se confirmó la hipótesis en relación a que las comunidades construidas con aislamientos del mismo entorno resguardan las interacciones indígenas formadas por la coadaptación / evolución.

Se construyeron biosensores enzimáticos cableados basados en la inmovilización de una oxidasa (glucosa oxidasa, lactato oxidasa ó peroxidasa) en un hidrogel redox formado por el entrecruzamiento de la enzima, polialilamina conteniendo un cornplejo de osmio (PAAOs) y polietilediglicidiléter (PEG) como entrecruzante, sobre electrodos de carbón vítreo y de oro. Se estudió el rango de linealidad y la reproducibilidad de estos electrodos al ser utilizados como detectores en un sistema FIA. Utilizando electrodos basados en glucosa oxidasa se estudió el efecto de distintas proporciones de entrecruzante (PEG); utilizando técnicas de voltametrías cíclicas se estudió el efecto del cambio de fuerza iónica en el medio. La leche afecta de manera irreversible a estos electrodos monoezimáticos. Se diseñaron distintos tipos de biosensores bienzimáticos bicapa, en los que peroxidasa entrecruzada con PAAOs se encuentra en la capa mas cercana al electrodo, y lactato oxidasa en la capa más externa. Se estudió el efecto de la leche sobre ambas capas enzimáticas, demostrandose que esta configuración es más apropiada para la determinación de la concentración de L-lactato en muestras Iácteas. Se ha descripto un método rápido para determinar la capacidad fermentativa de distintas especies de Lactobacillus. Este método permite cuantificar esta capacidad, proporcionando una información mas completa del metabolismo de los hidratos de carbono; posibilita el estudio de cepas mutantes suministrando inforrnación más completa acerca de las posibles modificaciones en el metabolismo de los fuentes de carbono utilizadas.

The main research of the Group of BioMEMS is the implantable microvalve for controlling the intraocular pressure in patients with glaucoma. Glaucoma is a disease that affects tens of millions of people around the world. The development of Micro ElectroMechanical Systems and the generation of new materials allow the development of implantable micro-devices with improved biocompatibility. The knowledge of biomolecules associated with the glaucoma pathology will increase the effectiveness of the implant. In this sense, a mass microsensor capable of sensing biomolecules is desirable; also the microsensor has to be capable of being integrated to the implantable microvalve. This thesis was focused on the design, simulation, fabrication and characterization of Micro ElectroMechanical Systems -based mass microsensors for the detection of biomolecules. It starts with a modeling and simulation chapter where different types of microsensors were developed by using piezoelectric resonators, and follows a fabrication and characterization chapter. Regarding the biocompatibility, Ultrananocrystalline diamond and Parylene were used as structural materials; as piezoelectric materials, quartz, polyvinylidene fluoride and Aluminium Nitride were used. The parameters of the resonators were extracted by using 3D Finite Element Method models and experimental results; values were adjusted to fit the simulated frequency response with the experimental one. Ultrananocrystalline diamond films used as substrate, yielded a highly oriented (002) Aluminium Nitride films even as thin as 80 nanometers; it exhibited a piezoelectric coefficient of about 5.3 picometer per volt, one of the highest demonstrated today.