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This thesis comprises the study of the kinetics of the avermectins regiospecific hydrogenation in homogeneous and heterogeneous phase with Rhodium-phosphines catalysts in a reactor with mechanical stirrer. At first, an experimental system and substrate purification technic are developed in order to guarantee the quality of the results to obtain kinetic data. Therefore, the avermectins hydrogenation is studied under homogeneous and heterogeneous catalysis so as to attempt improvement the industrial process. In heterogeneous phase, the feasibility of heterogeneization methods of catalytic complexes in biphasic systems is studied using additives different to minimize the resistance to the mass transfer at the interface. In homogeneous phase, an alternative with in-situ formed complexes is estudied to avoid the difficulties the preforming of them cause. The effects on the kinetic of the their in-situ synthesis and on the catalytic cycle are evalued. The technological implications show that a system of successive additions of substrate make possible the reuse of the catalyst at least up to three consecutive cycles of hydrogenation using low catalyst loading. An excellent activity with p-substituted phosphines ligands with electron-releasing groups is observed although it shows the disadvantage of a slow synthesis during the first stage. At last, the system is modeling with the aim to contribute to the basic area associated to the understanding of phenomena involved in processes the in-situ synthesis of complexes in avermectins presence and of catalitic cycle involved in their hydrogenation.

Streptomyces es un género bacteriano caracterizado por poseer un complejo ciclo de vida que involucra varios pasos de diferenciación fisiológica y morfológica. Durante su desarrollo, las bacterias de este género suelen producir una amplia gama de metabolitos con actividad biológica, que han sido tradicionalmente utilizados como antibióticos, antiparasitarios, antifúngicos, anticancerígenos, entre otros. Sin embargo, los Streptomyces son capaces también de sintetizar y acumular triglicéridos (TAG) como reserva de energía y carbono. Esta característica, si bien es inusual en bacterias, es compartida con otros géneros del orden de los Actinomicetales como Rhodoccocus, Nocardia y Mycobacterium. A pesar de su diversificado metabolismo lipídico, los estudios en el género Streptomyces se han concentrado generalmente en el área de la producción de metabolitos secundarios, y muy poco se conoce acerca de cómo este organismo sintetiza sus ácidos grasos y regula su flujo hacia fosfolípidos o TAG. Además, en S. coelicolor la síntesis de ácidos grasos y del metabolito secundario actinorrodina comparten un precursor clave, el malonil-CoA, lo que plantea un complejo escenario regulatorio para la síntesis de estos compuestos carbonados en este microorganismo. Así, como objetivo general de este trabajo de tesis nos propusimos identificar y caracterizar los mecanismos genéticos y bioquímicos que regulan la síntesis de ácidos grasos y lípidos de reserva en Streptomyces coelicolor. Para ello, en una primera etapa nos centramos en la caracterización de un regulador transcripcional de la síntesis de ácidos grasos en esta bacteria, FasR, con el fin de develar su rol fisiológico y entender de qué manera lleva a cabo su función regulatoria. Demostramos, mediante experimentos genéticos y bioquímicos, que FasR es un activador transcripcional del operón fab (fabD-fabH-acpP-fabF), el cual codifica para las proteínas esenciales del sistema de sintasa de ácidos grasos de tipo II de este organismo. FasR lleva a cabo su función uniéndose directamente a la región corriente arriba del operón fab, y su actividad estaría modulada por algún metabolito relacionado con el metabolismo de lípidos. A continuación nos planteamos identificar el paso enzimático que genera el diacilglicerol (DAG), un sustrato clave para la síntesis de TAG. A pesar del rol que juegan estas moléculas en las diferentes especies como reserva de energía y carbono, la ruta de abastecimiento de DAG para su síntesis es completamente desconocida en bacterias. En este apartado trabajamos bajo la hipótesis de que enzimas fosfatidato fosfatasas de tipo 2 (PAP2) serían las responsables de defosforilar al intermediario ácido fosfatídico y generar así el DAG necesario para la síntesis de TAG. A través de análisis informáticos fuimos capaces de identificar tres probables proteínas con actividad PAP. El posterior estudio de las mismas reveló que sólo dos de ellas, Lppα y Lppβ, eran capaces de defosforilar fosfatidato in vitro y tenían además un rol en el metabolismo lipídico de S. coelicolor. Una cepa mutante en ambos genes presentó niveles reducidos de TAG a tiempos cortos de crecimiento, equiparándose con los niveles de la cepa salvaje a tiempos mayores. Estas evidencias indican que si bien tanto Lppα como Lppβ estarían proveyendo DAG para la síntesis de TAG en S. coelicolor, existen en este organismo rutas alternativas de generación de DAG que prevalecen a tiempos largos de cultivo. Por último, con la información obtenida a partir de estos estudios básicos se reconstituyó la vía de síntesis de TAG en la bacteria no oleaginosa E. coli como prueba de concepto acerca de la funcionalidad de los genes caracterizados en la vía de síntesis de TAG en S. coelicolor. Para ello se utilizó como hospedador una cepa de E. coli ΔdgkA, que posee una deleción en el gen que codifica para una DAG quinasa capaz de reciclar el DAG hacia la síntesis de fosfolípidos. En este contexto se expresaron en forma heteróloga las enzimas fosfatidato fosfatasa Lppβ y DAG aciltransferasa Sco0958, que catalizan los dos últimos pasos de la síntesis de TAG. Si bien la sola expresión de Sco0958 demostró ser suficiente para la síntesis de TAG en este contexto genético, la expresión adicional de la fosfatasa Lppβ tuvo un efecto positivo en el contenido de TAG, confirmando su capacidad de generar el sustrato DAG limitante para la síntesis de TAG. Luego de una optimización de la cepa de E. coli productora de TAG, y de su cultivo en sistemas de alta densidad, fuimos capaces de obtener una producción de 722,1 mg TAG/L, lo que constituye el mayor título de TAG reportado para E. coli recombinantes en la literatura. En conjunto, estos resultados muestran cómo las evidencias que surgen a partir de estudios básicos pueden volcarse en el campo aplicado para resolver una necesidad particular. Sin embargo, a pesar de lograr el mayor título de TAG reportado hasta el momento para E. coli, es necesario aún incrementar la productividad volumétrica de TAG en este sistema para lograr el establecimiento de este huésped heterólogo como futura plataforma de biosíntesis de lípidos neutros aptos para la producción de, por ejemplo, biocombustibles.

A pesar de la vasta información acumulada sobre la represión catabólica, poco se conoce sobre su mecanismo molecular, y las evidencias presentadas son a menudo contradictorias. El AMPc y su proteína receptora actúan como mediadores de este efecto, siendo su lugar genético de acción el promotor lactosa. Pero ciertas líneas de investigación, en distintas condiciones experimentales, llevaron a mostrar que el fenómeno de represión y el rol del AMPc en el mismo no podían explicarse totalmente por un modelo de regulación positiva. Por ejemplo, la represión catabólica persiste en mutantes de E. coli que llevan deleciones de las regiones que controlan la transcripción en el sistema lactosa (33), lo que excluye la posibilidad de una única regulación a nivel de la síntesis del mensajero. Además cuando se observa la síntesis residual de β -galactosidasa, luego de bloquear la transcripción por distintas inhibidores, la adición de glucosa produce una disminución de la síntesis (30) y el agregado de AMPc estimula la traducción del mensajero lactosa (34). En este trabajo las etapas de transcripción y traducción fueron separadas y se observó la acción producida por distintos catalolitos en esta última. Los resultados obtenidos muéstran elocuentemente que cuando ambos procesos están desacoplados, la eficiencia diferente en la traducción del mensajero lactosa depende de la fuente de carbono utilizada en dicha etapa. El método utilizado para bloquear la biosíntesis de proteínas no influye sobre este resultado, si bien como se señaló anteriormente, la concentración de clorafenicol (5 ug/ml) resultó crítico para observar la posterior producción de β-galactosidasa.