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A partir de RNA genomico del virus de la fiebre aftosa (VFA), cepa O1 Campos, se sintetizó DNA copia (CDNA) utilizando los metodos de Nucleasa S1 y RNasa H alternativamente. Mediante los procedimientos de "tailing" o "blunt end ligation" dicho cDNA fue ensamblado a plasmidos vectores (pBR322 o pAT153 PvuII/8), obteniendose de esta manera una serie de recombinantes los cuales fueron clonados por transformación en Escherichia Coli. Los clones obtenidos fueron seleccionados por hibridización en colonias, utilizando como "probes" RNA viral o determinados fragmentos de cDNA obtenidos previamente. El analisis de los clones seleccionados mediante enzimas de restricción y secuenciación de DNA indicó que la suma de los insertos de 5 clones representa todo el fragmento "L" del RNA genómico (8000 bases). Posteriormente se obtuvo la secuencia de nucleótidos correspondiente al "gen" de Vp1, con dichos datos de secuencia se dedujó la estructura primaria del polipeptido Vp1. La comparación de la secuencia aminoacídica de la cepa 01 Campos con las secuencias de otras cepas (A10, O1K y C1) mostró la existencia de tres zonas de variabilidad, correspondientes a los residuos aminoacidicos 40-60, 134-160 y 195-213, de las cuales dos se encuentran en regiones hidrofílicas, mientras que la tercera se halla en un dominio hidrfóbico. El fragmento de cDNA correspondiente al "gen" de Vp1 fue subclonado dentro del vector de transposición miniMu denominado PR13, obteniendose el plásmido pmMVp1, el cual permite que el "gen" de Vp1 sea movilizado por transposición de un replicón a otro. Mediante dicha transposición se obtuvieron péptidos de fusión formados por Vp1 y ciertas proteínas de la placa basal del fago T4, los cuales presentan, en forma transitoria, los epitopes inmunogénicosde Vp1 en la superficie celular bacteriana.

Fil:Mandel, María Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las variedades de trigo con hábito de crecimiento invernal requieren una prolongada exposición a bajas temperaturas para acelerar la floración. Este requerimiento se denomina 'vernalización' y la variación natural en los genes que controlan este proceso ha favorecido la adaptación del trigo a diferentes ambientes. Los principales loci que controlan el requerimiento de vernalización en trigo se denominan VRN1, VRN2, VRN3 y VRN-D4. Los primeros tres genes han sido aislados y caracterizados pero VRN-D4 no ha sido identificado aún a nivel molecular. El objetivo de esta tesis es la identificación de VRN-D4 mediante clonado posicional, lo que incluyó la construcción de un mapa genético de alta densidad, un mapa físico, el estudio de los genes candidatos y su validación. Usando esta estrategia se encontró que VRN-D4 está localizado en la región centromérica del brazo corto del cromosoma 5D. En esta región se identificó la inserción un fragmento cromosómico de ~290Kb del cromosoma 5A incluyendo una copia del gen de floración VRN-A1. Usando mutantes inducidos por EMS este estudio demuestra que esta segunda copia de VRN-A1 es VRN-D4. VRN-D4 fue encontrado en muy alta frecuencia en la sub-especie T. aestivum ssp. sphaerococcum predominante en el sur del continente Asiático. Esta sub-especie carece de otros genes para hábito de crecimiento primaveral, lo que sugiere que VRN-D4 jugó un rol importante en la adaptación del trigo a esta región. Este estudio también identificó mutaciones en una región regulatoria de VRN-D4 asociadas a su expresión temprana. Mutaciones similares identificadas en alelos de VRN-A1 también estuvieron asociadas con un reducido requerimiento de vernalización. Los alelos de VRN-A1 y VRN-D4 identificados en este estudio representan una herramienta útil para regular la fecha de floración de trigo. Este estudio contribuye también al conocimiento básico de los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta a la vernalización.

Fil:Mesri, Enrique Alfredo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Ibañez, Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínas que se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). En el presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participar en el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doble híbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genes completos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostró similtud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee una región rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes son de copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. La expresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T. cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinas de G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNm de TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes o tripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos con la proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, en epimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. En amastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Se estableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa, proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa de histona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosis dependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismas variaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En los cultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. La actividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientras que la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3 son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el control del ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir la presencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el gen homólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó que es copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad de secuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadío especificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, se la purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero.

Two CDC2-related protein kinase genes (crk), tzcrk3 and tzcrk1, were cloned from the parasite Trypanosoma cruzi. Recombinant proteins were used to raise specific antisera. Antibodies anti-TzCRK1 recognized a protein of 33 kDa in the three forms of the parasite. This antiserum showed that TzCRK1 is localized in the cytosol, kinetoplast and nucleus, and is constitutiver expressed though the cell cycle. Purified anti-TzCRK1 IgGs, immunoprecipitated a kinase activity which phosphorylated histone H1 and Rb. The recombinant GST-TzCRK1 had high in vitro kinase activity in the absense of regulatory proteins. CDC2 and CDKZ specific inhibitors could not abolish the TzCRK1 kinase activity. Transfection of COS-7 cells with tzcrk1 demonstrated for the first time that a CRK protein can bind mammalian cyclins; TzCRK1 co-immunoprecipitated with cyclins E, D3 and A suggesting a role for this kinase in cell cycle control. The TzCRK3 antisera recognized a 40 kDa protein in membrane and nuclear fractions and a 54 kDa protein in the citosolic fraction. The p13SUC1 protein coprecipitated a kinase activity from the citosol of the epimatigote stage. Yeast complementation assays showed that these T. cruzi CRKs, could not rescue the yeast CDC28 function. The two hybrid system was used to identify and clone proteins that associate to TzCRK1. Three clones were identified, which code for proteins with identity to cyclins from the PREG and PHo80 family. In other organisms, these cyclin like proteins are involved in the control of phosphate metabolism. In S. cerevisiae, PH080 binds to the CDK protein PHO85, which controls the transcription of the acid phosphatase gene and participates in the regulation of the cell cycle. These results suggest that TzCRK1 could be involved in cell cycle progression and/or in other processes such as phosphate metabolism.

Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiología de la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado de una respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de células cardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerpos de pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13 aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocer el segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondiente a la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los del hospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuencias aminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieran producir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran para proteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Se obtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid rich protein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm de aproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró una identidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, y según ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasma del parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteína recombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de la proteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteína recombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda la proteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteraciones electrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia de inmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejar mejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de los antígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser mas adecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a punto esta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaron anticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en la infección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteraciones electrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueron inmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimos que la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocen epítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínas recombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento de generar una vacuna contra T. cruzi.

En este trabajo se clonó y se caracterizó estructuralmente un gen de tomate (Asr2), homólogo a un cADN inducible por ácido abscísico (ABA), estrés hídrico y maduración (Asr1) previamente clonado. Por otro lado, se comprobó la existencia de una familia génica, de por lo menos tres miembros, localizada en el cromosoma 4 a la cual pertenecen Asr1 Asr2. Para conocer la funcionalidad de la región 5' de Asr 2 en la expresión génica, estas secuencias fueron fusionadas al gen de la Β-glucuronidasa (GUS). Con la construcción resultante, se llevaron a cabo ensayos de expresión transitoria en Carica papaya L. mediante cañón génico y se obtuvieron plantas transgénicas de papaya, tabaco y papa vía cañón génico y A. tumefaciens. Los resultados muestran que la región 5' de Asr2 posee funciones de promotor in vivo y que además el ABA modula la expresión de GUS en ambos sistemas, transitoria y estable.

La ubicuitina es una proteína de 76 residuos aminoacídicos altamente conservada en la escala evolutiva, que se encuentra en todos los organismos eucarióticos, libre o conjugada covalentemente a proteínas. La función fisiológica de ubicuitina está relacionada con el camino de degradación proteica dependiente de ATP por vía no lisosomal, con la regulación del ciclo celular y con la respuesta a diferentes condiciones de estrés. A pesar de que la ubicuitina está codificada por una familia multigenética, ninguno de ellos lo hace para la proteína madura, sino para un precursor en el que la ubicuitina se encuentra fusionada por su extremo C-terminal a si misma (arreglo en tándem cabeza-cola en poliubicuitina), o bien, a una secuencia aminoacídica no relacionada con motivos de unión a ácidos nucleicos. En Neurospora crassa, la inhibición parcial de la sintesis proteica por tratamiento con cicloheximida, pero no con puromicina, conducen a un aumento de la población de transcriptos de poliubicuitina. Otras situaciones de estrés como ayuno, crecimiento en presencia de análogos de aminoácidos, estrés térmico, tratamiento con arsenito de sodio, que son inductores en otros organismos de la transcripción de este gen, no tienen efecto en Neurospora crassa. En nuestro laboratorio se aislaron y caracterizaron dos genes de ubicuitina de Neurospora crassa que corresponden, i) al gen de poliubicuitina y ii) a un gen de fusión. Estos genes clonados reconocen especies de ARN de 1,3 y 0,7 Kb, respectivamente en Northern blots. Los análisis de Southern blots parecerían indicar la existencia de un locus único para el gen de poliubicuitina que contiene 4 repeticiones en tándem cabeza-cola con un aminoácido extra fusionado al C-terminal del último monómero. El gen de fusión de Neurospora crassa corresponde a una unidad que codifica para ubicuitina ligada a una extensión de 78 aminoácidos, y su expresión se encuentra particularmente aumentada en conidias germinadas y en fase logarítmica. Las extensiones de fusión de ubicuitina pertenecen a una familia de proteínas ribosomales que además, están involucradas en el procesamiento del rARN de ambas subunidades. En condiciones de mayor replicación celular, los mensajeros correspondientes a estos genes de fusión se expresan activamente, como se encontró en Neurospora crassa. Se comprobó que el transcripto de 0,7 Kb no sufre variación en respuesta a los estrés estudiados, y que su expresión se reduce por ayuno. La comparación de la secuencia aminoacídica codificada por estos genes con la encontrada en otros organismos, contribuye a confirmar la alta conservación evolutiva de esta proteína. Sin embargo, el comportamiento particular de la respuesta al estrés en este organismo, plantea algunos nuevos interrogantes respecto a la regulación de la expresión del gen de poliubicuitina.