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La producción lechera argentina es una de las principales actividades agrícola/ganadera; en particular, la producción de quesos tiene un impacto significativo ya que viene incrementándose de manera sostenida en los últimos años. El Reggianito es el queso duro de pasta cocida más importante de nuestro país y numerosas estrategias se han estudiado en vistas a acelerar su maduración y conseguir un producto con calidad estandarizada. En este trabajo de tesis se caracterizó la capacidad de cepas de lactobacilos termófilos y mesófilos, comerciales y autóctonas, en la producción de compuestos de importancia en el flavor de quesos, y se verificó el efecto del medio de crecimiento, de la matriz y de las asociaciones entre las mismas. Los resultados indicaron la presencia de actividades enzimáticas clave para iniciar el catabolismo de aminoácidos en las cepas de lactobacilos termófilos, indicando su capacidad para participar en dichas reacciones durante la maduración del queso y conducir al desarrollo de flavor; lo que fue evidenciado en los modelos empleados. Por su parte, las diferentes combinaciones de pares de cepas termófilo/mesófilo analizadas produjeron perfiles de volátiles diferenciados, que en muchos casos se diferenciaron de las contribuciones individuales. Se verificó la influencia de la matriz y del medio de crecimiento de los cultivos en estos perfiles. Los resultados obtenidos en los quesos miniatura, particularmente la influencia del agregado de Lp 90 en quesos con Lh 209, fue verificada en los quesos elaborados a escala piloto.

El virus Junin genera, en ratones lactantes y en cultivos de células Vero, particulas capaces de inhibir su actividad citolitica y citopatogénica, como asi también su multiplicación "in vivo" e "in vitro“. Estas particulas se encuentran presentes en los stocks de virus y en cultivos persistentemente infectados, y se las puede inducir mediante pasajes concentrados ya sea en ratón o en células Vero. En este último huésped se obtienen los valores más altos de interferencia, aunque su proporción varia significativamente según la linea celular que se emplee y la procedencia del inóculo. Entre sus propiedades más importantes están las de ser neutralizables por inmuno suero anti-Junin, sensibles a solventes de lípidos y a temperaturas superiores a 50°C, estables a la radiación UV y al calentamiento a 37°C, tener un tamaño mayor o igual a 50 mu de diámetro y una velocidad de sedimentación similar a la del virus estándar. La interferencia que exhiben sobre la multiplicación del virus parental se produce en una etapa temprana del ciclo de crecimiento (dentro de las primeras 4 hs p.i.) y sólo se expresa con virus homo y heterotipicos. pero no heterólogos. El comportamiento biológico más significativo de las particulas interferentes consiste en moderar la replicación del virus estándar, protegiendo las células infectadas de su efecto citolitico, y prolongando el tiempo de sobrevida del ratón lactante. Cuando en ambos huéspedes se incrementa el intervalo entre la inoculación de PI y virus estándar se observa un aumento del efecto inhibitorio,ya sea porque disminuye la mortalidad del ratón en un 50%,o anula por completo el efecto citopático en los cultivos infectados. La presencia espontánea y habitual de estas particulas en las infecciones causadas por el virus Junin sugiere que ellas formarian parte de la estrategia utilizada por el virus para replicar y persistir en el huésped infectado.

Los grupos Fe-S son pequeñas moléculas inorgánicas con capacidad redox que se cuentan entre los cofactores más antiguos de la naturaleza. Las proteínas con centros Fe-S están involucradas en las principales rutas metabólicas y se encuentran ampliamente distribuidas en los tres reinos de la vida. La biosíntesis de estas moléculas inorgánicas requiere de un proceso controlado debido a que los iones Fe+2 y S-2 en sus formas libres son tóxicos para la célula. En organismos eucariotas y procariotas existen varios complejos proteicos encargados de la biosíntesis de los grupos Fe-S en diferentes situaciones fisiológicas denominados sistemas SUF, ISC y CIA. El mecanismo básico para el ensamblado de los grupos Fe-S en todos estos sistemas se puede dividir en dos etapas: la unión del hierro y el azufre a una proteína molde y la transferencia del centro Fe-S a las apoproteínas blanco mediado por chaperonas con especificidad variable. Se propone que los grupos Fe-S son liberados de Isu1, la proteína molde del sistema ISC, mediante la interacción de ésta con HscA, una chaperona de tipo Hsp70, en colaboración con la co-chaperona HscB, que estimula la función ATPasa de HscA. Dicha interacción provocaría un cambio conformacional de la proteína Isu1 y en consecuencia el centro Fe-S se liberaría de la proteína molde. Diversos estudios realizados, han mostrado que las proteínas que componen la maquinaria de la biogénesis de los centros Fe-S se han conservado en todos los eucariotas. Sin embargo, la chaperona mitocondrial HscA especializada en la formación de centros Fe-S, no fue transferida o no fue mantenida en las eucariotas ancestrales. Los análisis realizados sobre las chaperonas involucradas en la formación de los centros Fe-S han sugerido que la función de HscA fue adoptada por las chaperonas mitocondriales de los diferentes organismos, que además de cumplir su rol en el plegamiento de proteínas, actúan también en la biogénesis de los centros Fe-S. En Arabidopsis thaliana, la proteína molde AtIsu1 y la co-chaperona de tipo J AtHscB han sido halladas y estudiadas. La proteína AtIsu1 se expresa en todos los tejidos de Arabidopsis y puede reemplazar funcionalmente a la proteína homóloga Isu1 de Saccharomyces cerevisiae. Plantas de Arabidopsis deficientes en AtHscB tienen disminuida la actividad aconitasa y succinato deshidrogenasa, indicando que ésta proteína podría estar involucrada en la formación de los centros Fe-S. Se sabe relativamente de las chaperonas mitocondriales de Arabidopsis. Los genes AtHscA1 y AtHscA2 surgieron por duplicación génica y codifican para dos chaperonas mitocondriales que podrían estar involucradas en la biogénesis de centros Fe-S. Previamente, se ha demostrado que AtHscA1 puede reemplazar funcionalmente a Ssq1, la chaperona homóloga en S. cerevisiae, sugiriendo que AtHscA1 estaría involucrada en la biosíntesis de los centros Fe-S. Sin embargo, AtHscA2 no ha sido estudiada, y ésta última también podría participar en la vía de formación de los centros Fe-S. Con el fin de avanzar en la caracterización de la co-chaperona de tipo J de Arabidopsis thaliana, los genes AtHscB, AtIsu1 y AtHscA2 se expresaron en un sistema heterólogo bacteriano. La posterior expresión y purificación nos permitió analizar la interacción entre estas proteínas. Además, pudimos determinar la actividad ATPasa de la proteína AtHscA2 y analizar si AtHscB y AtIsu1 eran capaces de modular dicha actividad. De esta primera parte de la tesis, se desprende que AtHscA2 interacciona con AtHscB y AtIsu1 y que dicha interacción modula la actividad ATPasa de la chaperona. Estos resultados indican que, al igual que AtHscA1, AtHscA2 también podría estar involucrada en la biogénesis de los centros Fe-S. Con la intención de avanzar en la caracterización de AtHscB in vivo, en el segundo capítulo de esta tesis, se estudiaron plantas con ganancia y pérdida de función de dicho gen. Los resultados indican que ambos tipos de plantas presentan clorosis y menores áreas foliares que las plantas de tipo de salvaje. Además, las plantas sobreexpresantes desarrollan raíces anómalas, con disminución significativa del número y largo de las raíces secundarias. La actividad de enzimas con centros [Fe-S] como aconitasa y succinato deshidrogenasa (SDH) es la esperable en raíces: ligeramente aumentada en las plantas sobreexpresantes (AtHscBmyc) y notoriamente disminuida en las mutantes deficientes (athscb). Sin embargo, en las hojas, tanto las plantas AtHscB-myc como las athscb presentan actividades aconitasa y SDH disminuidas. Por otra parte, el análisis de los niveles de los transcriptos de aconitasa y SDH mostró un aumento en las hojas de las líneas athscb y una reducción de los mismos en las líneas AtHscB-myc, con respecto a las hojas de las líneas salvajes. Estos resultados, junto con evidencias previas que indican que la síntesis de los centros Fe-S afecta al metabolismo del Fe, nos llevaron a estudiar, en el tercer capítulo de la presente tesis, la relación entre AtHscB y la incorporación, la distribución y la regulación del Fe. Se pudo confirmar que la sobreexpresión de AtHscB produce activación del sistema de incorporación de hierro, acumulación del metal en la raíz y reducción en las partes aéreas, mientras que las plantas deficientes presentan acumulación de hierro en las partes aéreas, a pesar de tener niveles normales de captación de hierro. Además las tinciones de Perls parecen indicar que en las raíces de plantas athscb todo el hierro pasa a los haces vasculares, mientras que en las raíces de plantas AtHscB-myc el metal estaría atrapado en el espacio simplástico por fuera de las bandas casparianas. Teniendo en cuenta las anomalías en la distribución del hierro, se realizaron diversos experimentos para comprobar el correcto funcionamiento de los mecanismos de homeostasis del Fe. Así, se pudo verificar que la vía de respuesta a la deficiencia de hierro controlada por las partes aéreas opera correctamente, en todas las líneas en estudio. En consecuencia, finalmente, se propone la hipótesis y se aporta evidencia experimental, de que podría existir otro mecanismo regulatorio a nivel del transporte de Fe desde la raíz hacia las hojas, donde podría estar involucrado un sensor conteniendo centros Fe-S, que respondería al Fe acumulado dentro de la raíz. Con estos resultados, hipotetizamos que AtHscB podría estar regulando, directa o indirectamente el transporte del Fe desde las raíces hacia las hojas.

En este trabajo caracterizamos la expresión de 4 genes nucleares de Arabidopsis thaliana: dos genes codificantes para la subunidad Vb de la citocromo c oxidasa (COX5b) cox5b-1, At3g15640; cox5b-2, At1g80230), y dos genes codificantes para el citocromo c (cytc-1, At1g22840; cytc-2, At4g10040). Los patrones de expresión del promotor del gen cox5b-1 mostraron una fuerte expresión en meristemas y en tejido vascular de cotiledones, raíces e hipocótilos, en anteras, polen y en las venas centrales de las hojas. El análisis de deleciones sucesivas del promotor sugirió la presencia de elementos reguladores negativos activos en hojas, localizados entre los nucleótidos -609 y -387. La inclusión de sacarosa o de la citoquinina BAP en el medio de cultivo produjo un aumento de los niveles de expresión del reportero GUS. Mediante mutagénesis sitio-dirigidas del promotor del gen cytc-1 evidenciamos la presencia de un segmento localizado entre las posiciones -147 y -156 requerido para la expresión del mismo. El elemento site II (TGGGCC/T) localizado en dicha región, acoplado al elemento telo box (AAACCCTAA), serían los responsables de dirigir la expresión de este gen. El análisis de deleciones progresivas del promotor del gen cytc-2 indicó que una región conteniendo los motivos G-box y ACGT sería esencial para la expresión de dicho gen. La mutación en el motivo ACGT provoca la anulación de la expresión, mientras que elemento G-box conduciría a una disminución en los niveles de expresión en partes aéreas de la planta, anulando la expresión en raíces y la inducción por factores ambientales.