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Un conjunto de ensayos in vitro simples (identificación por PCR específicos, diversidad genética, crecimiento y viabilidad en la leche, resistencia a sales y compuestos de sabor, interacciones bacterianas, tolerancia al jugo gástrico simulado y a la bilis, deconjugacion de sales biliares, hidrofobicidad y actividades betagalactosidasa y antibacteriana), que puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio de Microbiología, principalmente en los países en desarrollo donde a menudo hay acceso limitado a técnicas sofisticadas, nos permitió identificar, entre diecinueve aislamientos humanos intestinales, un potencial candidato para nuevos alimentos lácteos probióticos para el mercado local. Lactobacillus gasseri LgF37/1 desarrolla bien en los medios de cultivo utilizados para la enumeración de bacterias probióticas en productos lácteos argentinos. Esta cepa también mostró elevada tolerancia a los desafíos tecnológicos evaluados, resistencia de sales biliares, la capacidad de producir metabolitos tipo bacteriocina como para inhibir las bacterias patógenas, deconjugar las sales biliares y alta hidrofobicidad. Más investigación in vivo debe llevarse a cabo con esta cepa antes de proclamar propiedades probióticas para ella. Sin embargo, el uso de un conjunto de técnicas sencillas in vitro resultó para ser importante para determinar que las cepas deben someterse a estudios futuros más complejos.

Desde el inicio de la utilización de variedades transgénicas, la superficie agrobiotecnológica ha aumentado exponencialmente, con un incremento del orden de 80 veces en solo 14 años, y su uso se ha expandido a más de veinte especies vegetales. Las ventajas obtenidas con estos cultivos transgénicos de primera generación incluyen: mejor control de insectos y malezas, mayor productividad, y una reducción del uso de agroquímicos. Los avances de la biotecnología en los últimos años permitirán, probablemente en un futuro muy cercano, el desarrollo de cultivos con características de interés para los consumidores, relacionadas con una mejora en la calidad nutritiva.. En este sentido las semillas constituyen un blanco ideal para este tipo de cultivos debido a sus propiedades de dormición, almacenamiento de nutrientes y la capacidad de germinar en condiciones limitantes de nutrientes. En este trabajo, se aislaron las regiones promotoras de tres genes específicos de semillas de girasol (Helianthus annuus L. HA89), que codifican para una proteína de transferencia de lípidos (HaAP10), una oleato desaturasa (HaFAD2-1) y una oleosina (HaOLE), las cuales fueron clonadas y caracterizadas “in silico”. Los fragmentos aislados de 964, 867 y 1838pb respectivamente, contienen en sus secuencias varios motivos específicos de semilla como elementos GCN4, motivos (AACA) y (ACTG), Prolamine-Box, E-Box, G-Box, sitos de unión SEF, Sh1 Box y elementos RY/G repetidos entre otros. A su vez, contienen motivos de respuesta a hormonas ABRE y GARE (ácido abscísico y giberélico) relacionados con desarrollo embrionario. Se realizaron análisis funcionales mediante la fusión de los promotores aislados al gen reportero GUS en plantas transgénicas de Arabidopsis y lechuga. No se observó actividad de la proteína reportera en ningún tejido vegetativo exceptuando los cotiledones de plántulas pequeñas. Al ser analizados a lo largo del desarrollo de la semilla, se observó tinción específica restringida a tejido embrionario. En los ensayos fluorométricos cuantitativos se observó actividad en estadios tardíos del desarrollo, similares a los patrones típicos de genes de reserva, siendo el HaFAD2-1 un promotor con una fuerte actividad especifica de semilla, con niveles similares a los del promotor constitutivo 35S. En este trabajo de tesis se confirmó que las regiones promotoras aisladas dirigen la expresión a semilla en forma específica y fuerte, con diferencias temporales, constituyendo, por lo tanto, importantes herramientas que podrán ser de utilidad en futuras aplicaciones biotecnológicas.

Fil:Fernández Cobo, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente trabajo, comprende el estudio químico de los componentes aislados y caracterizados en Morrenia brachystephana Griseb. (Asclepiadácea), y su extensión al estudio de otras 5 especies del mismo género. En el mismo se describen: I. La familia de las Asclepiadáceas incluyendo al género Morrenia, su abundancia y distribución geográfica y una enumeración de las sustancias aisladas de la familia registradas en la literatura, que en algunos casos se hallan concentradas en la misma. II. Los antecedentes sobre la acción biológica de M. brachystephana, "tasi", desde la pintoresca narración de Alcalde Espejo en 1871 hasta nuestros días, en que se corroboró la actividad mencionada mediante ensayos modernos con animales de laboratorio. III. Los alcanos de Asclepiadáceas, con una introducción en la que se indican las características de estos compuestos de interés quimiotaxonómico, su abundancia y variaciones estructurales, y el análisis comparativo de los resultados encontrados en las 6 especies de Morrenia estudiadas. IV. Los flavonoides, también de interés quimiotaxonómico, sus variaciones estructurales, interrelaciones y biosíntesis de los distintos tipos. V. El triterpeno germanicol, componente mayoritario de los extractos en éter de petróleo de las especies estudiadas, una revisión bibliográfica de su aislamiento de fuentes vegetales, su determinación estructural, tranformaciones en medio ácido y biosíntesis de triterpenos pentacíclicos. VI. La discusión de los resultados obtenidos, indicando cómo se efectuó la separación y determinación estructural de las sustancias halladas. Estudio de los espectros de resonancia magnética de hidrógeno y de masa del germanicol y derivados. Se analiza la distribución de los flavonoides en las especies de Morrenia, frente a posibles relaciones taxonómicas, y se indican otros flavonoides aislados de Asclepiadáceas. También se comenta la evolución de los flavonoides en plantas superiores. VIII. La Parte Experimental, en la que se detallan las técnicas empleadas y los procedimientos seguidos en el aislamiento y cracterización de los distintos compuestos en los extractos en éter de petróleo y metanol en M. brachystephana. Posteriormente, se indican los datos obtenidos en la ampliación de este estudio a otras especies de Morrenia. Finalmente en un Apéndice se dan los datos de recolección de cada una de las especies estudiadas. Las referencias bibliográficas están ordenadas según orden alfabético del primer autor del trabajo y año del mismo, y aparecen al final de la Tesis.

Fil:Fernández Murray, Jorge Pedro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los LePRKs son receptores quinasa que se localizan en la membrana plasmática de polen, posiblemente mediando interacciones polen-pistilo. Previamente, hemos demostrado que LePRK2 se encuentra fosforilada en polen maduro y germinado, y se desfosforila cuando microsomas de polen son incubados con extractos de estigma-estilo. Esto sugiere que por lo menos LePRK2 podría estar transduciendo una señal del pistilo a través de la actividad de LePRK2. En esta tesis, mostramos que la desfosforilación de LePRK2 está mediada por una molécula proveniente del pistilo resistente al tratamiento térmico, alcalino y proteasas. Basándonos en la desfosforilación de LePRK2, desarrollamos un protocolo de purificación con el cual obtuvimos un pico aislado de ~3550 Da (determinado por UV-MALDI-TOF MS) correspondiente a esta molécula peptídica que nombramos MrX. Con el fin de evaluar los efectos de MrX en tubos polínicos en crecimiento, realizamos ensayos de germinación in vitro en presencia de MrX parcialmente purificado y determinamos la longitud del tubo polínico como marcador del estado fisiológico. La adición de MrX al medio de germinación resultó en un aumento del largo del largo del tubo polínico en una forma dependiente de la dosis, mientras que las fracciones control no tuvieron efecto alguno. Nuestra hipótesis plantea que las interacciones polen-pistilo a través del complejo de LePRKs involucran la percepción de MrX por LePRK2, seguido de una desfosforilación de ésta y un incremento de la tasa de crecimiento del tubo polínico.

Objetivos de la tesis: - Aislamiento de fagos de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). - Caracterización de los fagos aislados. - Desarrollo de matrices de encapsulamiento de fagos y estudio in vitro de la capacidad protectora frente a la acidez para el suministro de bacteriófagos a bovinos por vía oral. - Determinación de las condiciones óptimas de conservación de los fagos.

La epilepsia es un grupo heterogéneo de desordenes neurológicos que afecta al 3% de la población mundial. El 30% de los pacientes epilépticos no consigue controlar sus convulsiones con las drogas antiepilépticas (AEDs) disponibles. Existe por lo tanto la necesidad de buscar nuevas AEDs que sean más eficaces y posean menor toxicidad, siendo los productos naturales una alternativa válida como fuente de nuevas estructuras. Eugenia uniflora L (Mirtaceae) es un arbusto ramificado y globoso, utilizado en la medicina tradicional en Brasil, Paraguay y NO de Argentina, sus nombres más comunes son “pitanga” y “ñangapirí” Las hojas desecadas de Eugenia uniflora fueron secadas y molidas. 250 g del polvo fue extraído sucesivamente con hexano y metanol por maceración en frío y se preparó una infusión y un cocimiento (según FNA VI Ed.) del polvo del material vegetal al 5 % y 10% P/V, respectivamente. Los extractos hexánico, metanólico, la infusión y el cocimiento fueron evaluados de acuerdo al Anticonvulsant Drug Development (ADD). Los extractos fueron evaluados en su actividad anticonvulsiva, frente al MES test y PTZ test. El extracto metanólico fue fraccionado por distintas técnicas cromatográficas y las fracciones fueron analizadas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-DAD) y cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG- MS). El extracto metanólico demostró una actividad anticonvulsiva importante, como así también la fracción obtenida por precipitación que presentó una actividad anticonvulsiva 50% efectiva, dando hasta los 30 minutos 75 % efectividad, aumentando el umbral de las convulsiones clónicas inducidas por la administración de PTZsc. Se lograron identificar cuatro compuestos en la fracción activa de Eugenia uniflora.

Eugenia uniflora L., es una especie nativa, arbustiva que pertenece a la familia Myrtaceae; es ampliamente usada en la medicina tradicional, con reconocimiento de vastos compuestos químicos y propiedades biológicas. Los objetivos de la investigación fueron extraer y aislar principios activos a partir de las hojas y realizar una búsqueda de posible actividad antimicrobiana en los extractos no polares obtenidos. El material vegetal, secado y pulverizado, fue extraído con hexano mediante maceración, concentrado y obteniendo un Extracto Hexánico Concentrado (EHC) que fue fraccionado por cromatografía en columna. Se colectaron 150 fracciones reuniéndose veintidós que presentaron un comportamiento cromatográfico semejante, a las cuales se les realizaron un seguimiento bioguiado: Fr1-9, Fr1-14, Fr1-15, Fr1-16, Fr1-20 y Fr1-22. En la FrD3, procedente de Fr1-22, fue identificado el ácido ursólico a través de una CCD contra testigo. Del fraccionamiento de Fr1-20 por cromatografía preparativa en columna se obtuvo la Fr2-10, en donde fue caracterizado el acetato de bornilo. FrD3 y Fr2-10 fueron analizadas a través de HPLC – HRMS, por ionización a presión atmosférica (API) y el detector usado fue Masa de Impacto Electrónico (IE), encontrando en FrD3 el pico del ión molecular m/z 456 [M+] correspondiente con el ácido ursólico y en Fr2-10, m/z 196 [M+] compatible con el acetato de bornilo. Los estudios fueron complementados con tablas de las fracciones analizadas, especificando los distintos picos, a diferentes señales, con su m/z resaltando aquellas coincidentes con m/z del espectro de masas de cada uno de los compuestos, provenientes de una base de datos. Fr1-9 y Fr1-15 fueron analizadas en HPLC-MS en LC/ MSD VL Agilent Technologies 1100 Series Liquid Chromatography en un rango de m/z 50 a 1500, con detector Masa APCI. En Fr1-9 se identifica la Pulegona al comparar con su espectro homónimo aportado por la base de datos. En Fr1-15, el Germacrone, correspondiente a m/z 218 [M+] y los otros fragmentos característicos aportados por la base de datos permitió realizar posibles vías de fragmentación con la obtención de diferentes compuestos con una m/z coincidente a algunas señales de la fracción. Se determinó la actividad antimicrobiana en Fr1-9, Fr1-14, Fr1-15, Fr1-16, Fr1-20, Fr1-22, EDCMT y Fr2-10 a través del método de difusión: “cilindro placa” (USP 29) y el “Contact bioautography” como método bioautográfico. Se emplearon los microorganismos: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 y Staphylococcus aureus ATCC 29737 y el antibiótico estándar fue Ceftazidina. Los resultados mostraron inhibición de crecimiento frente a Staphylococcus aureus en todas las fracciones analizadas. La Bioautografía resultó ser un método útil para encontrar componentes naturales activos. De acuerdo al Rf del ácido ursólico, en los sistemas cromatográficos empleados, y la ubicación de los componentes químicos en la placa cromatográfica con actividad antimicrobiana, podría presumirse que uno de los compuestos presentes en el extracto hexánico con acción biológica sería el ácido ursólico.

En esta tesis se describe el aislamiento, bioguiado a través de ensayos de actividad antifúngica y/o antibacteriana, y la elucidación estructural de los metabolitos presentes en los cultivos de hongos provenientes de diversas fuentes naturales. Las especies analizadas Alternaria brassicicola, A. raphani, Aspergillus restrictus, Trichoderma koniigii y Ascosphaera apis fueron aisladas de polen de colmenas ubicadas en el apiario del INTA (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria) de la ciudad de Balcarce, Buenos Aires, Argentina. De Alternaria brassicicola y A. raphani se aislaron los compuestos 1-4, siendo el ácido tenuazónico, compuesto 2, el responsable de la actividad antibacteriana frente a la bacteria P. larvae, patógena de las larvas de las abejas melíferas. El compuesto 1, ácido D-allo-tenuazónico, es aislado por primera vez como producto natural. De Aspergillus restrictus se aisló el compuesto 3, conocido como pseurotina A3. Del hongo entomopatógeno de las larvas de las abejas melíferas, Ascosphaera apis, se aislaron los compuestos 6-8, siendo 6 y 8 monoterpenos de estructura química no informada previamente. Los compuestos 6 y 8 mostraron actividades antibióticas, antifúngicas y antioxidantes moderadas, mientras que el compuesto 7 posee buena actividad frente al hongo fitopatógeno F. virguliforme. Del cultivo de Trichoderma koningii se aislaron los compuestos 9, ácido hidroxiaspergílico, y 10, ácido terréstrico, ambos con actividad antifúngica importante frente a F. virguliforme. El estudio del cultivo de una cepa endófita septada oscura (DSE1) aislada de raíces de plantas de soja, brindó los compuestos 11-13. Dichos metabolitos son activos frente a los hongos F. virguliforme y F. lateritium. Se sintetizaron nuevos agentes antimicrobianos previamente aislados del cultivo del hongo intermareal Acremonium furcatum, compuestos 14 y 15. Los intermediarios sintéticos 21 y 22 resultaron poseer muy buena actividad antifúngica frente a F. virguliforme, Aspergillus fumigatus, Botrytis cynerea, Colletotrichum trucatum y Macrophomina phaseolina. Todos los extractos de las especies estudiadas fueron fraccionados mediante distintas técnicas cromatográficas hasta la obtención de los metabolitos de interés puros. La elucidación estructural se llevó a cabo utilizando principalmente experimentos de RMN-1D y 2D, junto con espectrometría de masa.