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Las adenilato quinasas son fosfotransferasas que participan en la homeostasis intracelular de nucleótidos de adenosina. Se postula que constituyen los componentes clave de las redes enzimáticas de fosfotransferencia. Las mismas comunicarían, de forma espacial, los sitios de generación con los de consumo de ATP. Los kinetoplástidos, entre los que se incluye el parásito causante del mal de Chagas, el Trypanosoma cruzi, representan a los organismos con mayor número de isoformas de adenilato quinasas del que se tenga conocimiento. En este trabajo se desarrolló una herramienta de rastreo de bases de datos con la que se pudo identificar a seis isoenzimas codificadas en el genoma de Trypanosoma cruzi. Se estudiaron diferentes aspectos de cada una de las mismas. Algunas variantes fueron localizadas en la estructura flagelar, en el lumen glicosomal, solubles en el citosol y posiblemente asociadas a reservosomas. Adicionalmente se estudiaron los dominios y motivos responsables de su respectiva localización. Por otro lado se investigaron tres de las isoformas presentes en Trypanosoma brucei. Se determinó la esencialidad de la isoforma candidata mitocondrial, los patrones de expresión estadío específicos para la isoenzima glicosomal y además la potencial presencia de una señal críptica de localización a esta organela, en otra de las variantes. Finalmente se evaluaron metodologías de reemplazo génico dirigido en Trypanosoma cruzi y se desarrollaron numerosas herramientas que permiten la manipulación genética de este tripanosoma. Entre estas se encuentran vectores de expresión con diferentes marcadores de selección, plásmidos mínimos con marcadores de selección de sencilla transferencia y secuencias codificantes para múltiples epítopes, proteínas fluorescentes y sitios de proteasas. Se espera que estas herramientas sean de utilidad para futuras investigaciones de tripanosomas y otros organismos.

Universidad Nacional de Quilmes. Laboratorio de Expresión y Plegado de Proteínas (LEPP).

Toxoplasma gondii es uno de los parásitos protozoarios más ampliamente distribuidos a nivel mundial, y usualmente causa una enfermedad asintomática en los humanos. Sin embargo, la reactivación de la infección crónica en pacientes inmunocomprometidos, y la toxoplasmosis congénita de una infección primaria adquirida durante el embarazo, presentan cuadros clínicos muy severos e incluso puede causar la muerte del paciente. Además, debido a que T. gondii causa mortalidad de los neonatos en ovejas, también representa una causa importante de pérdida económica en las granjas. En este trabajo dos familias de ADN repetitivas de T. gondii fueron caracterizadas. ABGTg7 (721 bp) presenta dos monómeros repetidos completos y 55 nt de un tercero, mostrando una disposición de tandems directos cuya unidad repetida es de aproximadamente 340 bp. ABGTg8 (1002 bp) contiene dos elementos repetidos distintos: uno denominado ABGTg8.2 y un elemento ABGTg7. ABGTg7 y ABGTg8.2 muestran patrones de hibridación muy similares en Southern-blots de ADN de T. gondii digerido con distintas endonucleasas de restricción, sugiriendo que ambos elementos principalmente se encuentran en la misma estructura repetitiva en tandem en el genoma. Análisis de PFGE mostraron que estos elementos repetidos se encuentran en al menos tres de los 4 cromosomas más grandes de T. gondii. Ensayos de sensibilidad a la endonucleasa Bal 31 indicaron que se encuentran localizados cerca de los telómeros de los cromosomas así como también en otras regiones de los mismos. Cinco fagos lambda recombinantes genómicos fueron aislados y dos clusters diferentes completos de la estructura repetitiva fueron analizados. Ambos clusters contienen uno de sus extremos conservados con un fragmento de 4.4 Kbp donde se halla ubicado ABGTg8.2, ligado a numerosos fragmentos Sal I conteniendo todos al menos una copia de los monómeros de ABGTg7. Dentro de estos clusters ambos elementos repetidos forman parte de una estructura compleja en tandem, donde los monómeros de ABGTg7 se encuentran dispuestos tanto como tandems directos como flanqueados por otros elementos repetitivos sin o con baja homología entre ellos. Esta estructura repetitiva en tandem cumple los requerimientos asignados al ADN satelital. Por otra parte, se evaluó el uso potencial de la secuencia ABGTg7 para el diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Se realizaron ensayos de hibridación mediante la técnica de Dot-blot en muestras de sangre de pacientes con toxoplasmosis cerebral (CT), linfoadenopatía toxoplásmica (ATL) y toxoplasmosis diseminada en pacientes trasplantados (TR). Se estudió un total de 84 individuos. Se encontraron señales positivas por Dot-blot en 12 (66.7%) de 18 casos con CT confirmada, 9 (52.9%) de 17 casos con ATL y 2 (66.7%) de 3 casos con TR con toxoplasmosis. En paralelo se realizaron ensayos de PCR en los pacientes con ATL, resultando en la detección de ADN de T. gondii en 10 casos (58.8%). Un estudio comparativo entre el Dot-blot y la PCR fue realizado también en ratones experimentalmente infectados con taquizoitos, el cual arrojó resultados similares: 60% y 70% de valores positivos respectivamente. Finalmente la suma de valores positivos obtenidos con ambos tests (Dot-blot más PCR) incrementó el número de sospechas de infección toxoplásmica en los pacientes con ATL a un 76.4% de casos. Por otro lado, si se consideran los resultados positivos obtenidos simultáneamente por las dos técnicas, se confirmó el resultado en el 35.2% de los casos. Estos resultados indican que la sonda repetitiva ABGTg7 es un recurso adicional útil para el diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudios básicos sobre la organización genómica de estos elementos repetidos, se desarrolló un ensayo de PCR basado en la secuencia ABGTg7 con el objeto de ser evaluado como herramienta diagnóstica.

En los últimos años se ha incrementado el interés por el cultivo del amaranto debido a: su contenido proteico y ventajas agronómicas (rendimiento y resistencia a la sequía). En esta tesis se obtubieron concentrados proteicos de Amaranthus mantegazzianus, en planta piloto por precipitación isoeléctrica tradicional y métodos alternativos de extracción ácida inicial combinada con precipitación isoeléctrica y ultrafiltración. Además se obtuvieron dos hidrolizados. Las muestras se caracterizaron en cuanto a su contenido proteico y se determinó el rendimiento para cada etapa de separación. También las mismas fueron analizadas por: electroforesis, cromatografía de exclusión molecular, solubilidad, hidrofobicidad superficial, contenido de aminoácidos y de compuestos fenólicos, actividad antioxidante y propiedades de espumado. Con el método tradicional se obtuvo el mayor rendimiento de extracción (19,1%) y con el método alternativo de precipitación isoeléctrica la mayor concentración de proteínas (73,1%). La harina de A. mantegazzianus mostró ser deficiente en leucina y lisina de acuerdo al patrón FAO; presentó un mayor contenido de metionina, histidina y tirosina respecto a otras variedades y un alto contenido de compuestos fenólicos y buena actividad antioxidante. El contenido de lisina aumento en un 80% en el concentrado de ultrafiltración. Los perfiles electroforéticos y cromatográficos mostraron diferencias de bandas y picos entre las muestras. Los compuestos fenólicos se lograron extraer mayoritariamente en la extracción ácida inicial resultando fracciones con distinto contenido de estos compuestos. La hidrólisis enzimática aumentó la solubilidad, los compuestos fenólicos y la actividad antioxidante del concentrado de partida, aunque fue excesiva para mejorar las propiedades de espumado.

Las pérdidas en cultivos ocasionadas por virus dependen mayormente de la severidad de los síntomas producidos. La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la producción de síntomas es de importancia para el desarrollo de estrategias que permitan reducir las pérdidas ocasionadas por fitovirus. Mediante el uso de cepas de virus de los géneros Tobamovirus y Potyvirus, el presente trabajo analizó la relación entre la severidad de sus síntomas en Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana con su capacidad para alterar diferencialmente parámetros morfológicos, fisiológicos y transcriptómicos relevantes para los procesos de desarrollo y respuestas a estrés, hormonas y defensa. Los resultados indicaron que a tiempos tempranos de la infección en tejidos sistémicos, cuando aún no son visibles los síntomas característicos de la infección, se producen cambios moleculares importantes. Éstos incluyen alteraciones en la acumulación de metabolitos vinculados con procesos de señalización y defensa, así como cambios transcriptómicos en genes clave en redes de senescencia, defensa y respuesta a hormonas. La respuesta de microRNAs con importantes roles en el desarrollo ante tratamientos con hormonas y virus exhibió un componente transcripcional y muchos de estos genes reguladores evidenciaron un patrón bifásico de cambios, sugiriendo que los procesos que conducen a su alteración en etapas tempranas de la infección difieren de los que condicionan la misma a etapas avanzadas. En Arabidopsis, gran parte de las diferencias en alteraciones fisiológicas y de síntomas inducidas por distintas cepas de un Potyvirus se perdieron en plantas mutantes para la vía del ácido salicílico. A la luz de estos hallazgos, se propone un mecanismo por el cual la retroalimentación entre ácido salicílico y especies reactivas de oxígeno determina la activación de genes clave en los procesos de desarrollo y senescencia.

Se produjo un producto co-secado (CS) de concentrado de proteínas lácteas (WPC) y lambda- carragenina (l-C). Se estudiaron emulsiones al 50%, con CS y con WPC solo, preparadas en Ultra-Turrax (UT) y homogeneizador a válvula (HV), midiendo tamaño de partículas, microscopía, viscosidad y estabilidad óptica. La l-C condujo a una desagregación del WPC y favoreció su solubilidad, por lo que existirían interacciones del tipo electrostático entre ambos, lo que se vería corroborado en los estudios de viscosidad. Además se observó un incremento en la estabilidad térmica de las proteínas en presencia de l-C. En UT, las emulsiones con WPC presentaron un comportamiento de sistemas concentrados, poli-dispersos que se tornaron mono-dispersos con el incremento de la concentración y con bajo grado de floculación. Las emulsiones con CS presentaron características similares pero una mayor estabilidad, lo que se debería a la l-C. En HV, las emulsiones con WPC presentaron una mayor estabilidad que podría ser atribuida a una estructura generada por un mecanismo de floculación por depleción inicial, debido a la presencia de agregados proteicos, seguido de una estabilización por puentes o multi-capas entre proteínas. En las emulsiones con CS, a bajas concentraciones de proteína, la l-C incrementó la velocidad de desestabilización probablemente por un mecanismo de floculación por puentes. Luego las emulsiones fueron mas estables debido principalmente a floculación por depleción por la l-C. y probablemente a floculación por puentes o multi-capas entre proteínas. Estos resultados demuestran que sería posible desarrollar un aditivo tipo agente emulsionante/ estabilizante con los sistemas estudiados.

Lotus japonicus es una legumbre modelo ampliamente utilizada para el estudio de procesos importantes como la nodulación y la respuesta al estrés salino. Sin embargo, existen pocos estudios sobre la respuesta defensiva de esta especie contra microorganismos patógenos. Comprender como se protege esta especie modelo contra patógenos podría ayudar a desarrollar cultivares más tolerantes en especies de Lotus de relevancia agronómica, así como también en otros géneros de legumbres. Para poder dilucidar los mecanismos de defensa más importantes en esta leguminosa, en este trabajo se exploraron las principales respuestas de dos ecotipos fenotípicamente contrastantes, Miyakojima MG-20 y Gifu B-129, a la inoculación con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Las respuestas de defensa activadas en ambos ecotipos fueron considerablemente diferentes. Así, en Miyakojima MG-20 se observó una interacción compatible caracterizada por una rápida multiplicación de la bacteria, acompañada por un descenso en la eficiencia del fotosistema II, la aparición de clorosis, desecación y defoliación, así como un moderado pero sostenido aumento en los niveles de especies reactivas del oxígeno (EROs). Estos fenómenos sólo fueron observados en los folíolos inoculados y no afectaron el desarrollo normal de la planta. Por su parte, en Gifu B-129 la interacción fue incompatible, los síntomas fueron en general imperceptibles, la bacteria fue incapaz de multiplicarse en los tejidos de la planta y existió un aumento notable de las EROs durante las primeras horas luego de la inoculación con la bacteria. A partir de estudios transcripcionales utilizando microarreglos de ADN, pudieron identificarse alrededor de 3000 genes regulados diferencialmente frente a la inoculación con la bacteria en el ecotipo Miyakojima MG-20 y alrededor de 300 genes en el ecotipo Gifu B-129. Además, se comparó la expresión génica basal de estas líneas, observándose diferencias en genes relacionados con estrés biótico y abiótico, metabolismo hormonal, estado redox y procesos fotosintéticos. Por otro lado se realizó un estudio del metaboloma, en el cual también se observó un comportamiento contrastante entre ambos ecotipos, detectándose un conjunto diferente de metabolitos que se modifican frente a la inoculación con la bacteria. Integrando los resultados del transcriptoma y del metaboloma se pudieron identificar numerosas vías metabólicas afectadas de manera diferencial en respuesta al ataque bacteriano, lo que permite explicar las diferencias de comportamiento observadas entre ambos ecotipos. Entre estas vías se destacan el sistema de antioxidantes (ascorbato y glutatión), el metabolismo del ácido γ-aminobutírico, la síntesis y degradación de componentes de la pared celular, la síntesis y degradación lípidos y el metabolismo hormonal. Posteriormente, sobre la base del análisis transcriptómico se seleccionaron distintas líneas mutantes insercionales del ecotipo Gifu B-129 para un conjunto de genes que podrían jugar un rol importante en la defensa vegetal. La mayoría de tales líneas demostró una tolerancia equivalente a la observada en la línea salvaje, sugiriendo que los genes mutados no son esenciales en la respuesta de defensa en estos ecotipos. Sin embargo, una línea incapaz de expresar el gen de la enzima Poliamina Oxidasa I demostró una mayor tolerancia durante la patogénesis, lo que indicaría que la expresión de este gen afecta negativamente la respuesta defensiva de la planta. Este trabajo permitió describir de manera global las principales vías metabólicas reguladas en dos ecotipos de L. japonicus durante la respuesta a la bacteria P. syringae pv. tomato DC3000. Las diferencias entre las respuestas inducidas en el ecotipo Gifu B-129 (interacción incompatible) con las observadas en el ecotipo Miyakojima MG-20 (interacción compatible) permitieron discernir cuales son los mecanismos de defensa más efectivos entre los presentadaos por los ecotipos evaluados. Estos resultados podrían ser extrapolados a otras especies de leguminosas de interés agronómico.

Torchio, G. M. (2016). Estudio fisicoquímico de modelos de plegado complejos: el caso del dominio PDZ de la proteína β2–Sintrofina. (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina: Universidad Nacional de Quilmes.

Objetivo. El propósito de este estudio fue investigar la influencia de factores físicos, físico-químicos y químicos sobre la formación de película adquirida, bajo condiciones in vitro e in situ. Materiales y Métodos. Se llevó a cabo un estudio experimental en dos fases. En la primera de ellas (in vitro) se incubaron a 37°C por 90 min. una mezcla de hidroxiapatita y sobrenadante de saliva mixta, para determinar la influencia de la disponibilidad de proteínas, el pH, el agregado-sustracción de ciertos iones, la temperatura, la fuerza iónica y diversos inhibidores-removedores de placa bacteriana sobre la formación de película adquirida. En la segunda fase (in situ) se evaluó el efecto de una mezcla de xilitol, sorbitol y manitol, aplicada como enjuagatorios y gomas de mascar, sobre la formación de película adquirida utilizando bloques dentarios humanos insertos en retenedores que fueron colocados durante 120 min. en ambos maxilares de voluntarios jóvenes. Resultados. Bajo condiciones in vitro, la retención por hidroxiapatita de las proteínas salivales (formación de película adquirida) aumenta proporcionalmente a su concentración en el sistema, de acuerdo a un fenómeno de adsorción relativamente específico. La adsorción de proteínas alcanzó su máximo a los 30 min. de incubación, a pH 6,0 y a la temperatura de 24°C. La incorporación de iones calcio al sistema de ensayo incrementó la formación del integumento de manera proporcional a la concentración del ión. El fosfato produjo un efecto inverso. El agregado de clorhexidina (0,12% y 0,24%), fluoruro de sodio (0,10%) y hexetidina (0,10%) no afectó significativamente la formación del integumento. En cambio, la adición de xilitol, sorbitol y manitol produjo una significativa reducción en la cantidad de proteínas (28-31%), glucoproteínas (20-24%) y -amilasa (41-44%) retenidas por hidroxiapatita, en forma proporcional a la concentración del azúcar-alcohol. Esta reducción fue parcialmente revertida por la adición de calcio iónico (3, 6 y 12 mM). La formación de placa bacteriana a partir de una cepa de Streptococcus mutans o de flora aeróbica total de saliva fue alrededor del 40% menor cuando la película adquirida se formó en presencia de xilitol 10%. Bajo condiciones in situ, el tratamiento con enjuagatorios conteniendo una mezcla de xilitol, sorbitol y manitol no modificó en forma significativa el contenido de proteínas, glucoproteínas, -amilasa y ácido siálico de la película adquirida, ni la producción de placa bacteriana. Por el contrario, el consumo de gomas de mascar edulcoradas con dichos polialcoholes redujo la adsorción al esmalte de todos los componentes analizados, y la formación de placa dental. Conclusiones. La producción de película adquirida representa un fenómeno complejo que, entre otros factores, depende tanto de la calidad de los fluidos bucales como de las condiciones en que se desarrolla el fenómeno. La presencia de xilitol, sorbitol y manitol, al reducir la producción de la película adquirida, disminuye la colonización microbiana de los dientes, lo cual sumado a otras propiedades, convierten a estos azúcares-alcoholes en agentes recomendables para prevenir las enfermedades bucales dependientes de la placa bacteriana.

Fil:Rosemblit, Nora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.