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El presente trabajo de tesis tiene tres partes principales. En la primera parte se describen estudios de producción de PGasa por A. sojae en cultivos sumergidos aprovechando residuos agroindustriales, poniendo especial atención en el uso de cáscaras de soja. Luego de un estudio preliminar de producción con varios subproductos, se eligió emplear cáscaras de soja y se continuó con la búsqueda de componentes relevantes del medio de cultivo y optimización de los mismos para maximizar la actividad PGasa, empleando fundamentalmente diseño experimental multivariado y metodología de superficie de respuesta. De esta forma se mejoró la productividad volumétrica al doble mediante una variación en el pH inicial del cultivo en un rango muy pequeño de pH ácido que oscila en 2.60. El proceso optimizado se transfirió exitosamente a biorreactores de tanque agitado en términos de productividad volumétrica. A su vez, se obtuvo una actividad PGasa de 42 U/ml con un rendimiento de 1.39 U/g de cáscara de soja, un valor que se sitúa dentro de los más elevados reportados con este subproducto. El incremento de la concentración del medio de cultivo al doble en biorreactor no se tradujo en una duplicación de la productividad volumétrica, y la evolución del oxígeno disuelto a lo largo del proceso es coherente con una limitación del cultivo en oxígeno. En este medio de cultivo el microorganismo produjo también actividad xilanasa. La caracterización morfológica del cultivo reveló que A. sojae se desarrolló como micelio disperso a valores de pH inicial de 2.40 -2.80 mientras que, a la inversa, a pH 5.40 predominó la morfología de pellets. Por otro lado, se estudió la producción de actividad PGasa con cáscaras de naranja, pomazas de durazno y damasco, empleando una cepa de A. sojae superproductora. Se utilizaron diseños de superficie de respuesta de Doehlert para estudiar la producción de PGasa con estos tres residuos por separado, y finalmente el cultivo se transfirió a biorreactores de tanque agitado en los que se ensayaron diferentes perfiles de agitación y aireación con un medio de cultivo compuesto por una mezcla de cáscaras de naranja y pomaza de damasco. Controlando el oxígeno disuelto con el flujo de aire a un valor fijo de agitación (600 rpm), la tensión de oxígeno disuelto se mantuvo sobre el 25 % a lo largo del cultivo y se obtuvieron los mejores resultados, una producción de 380 U/ml, que representa una mejora en 1.5 veces respecto a los niveles obtenidos llevando a cabo la fermentación a flujo de aire y velocidad de agitación constantes (1 vvm y 600 rpm). En la segunda parte se describe la producción, purificación y posterior caracterización de una endo-poligalacturonasa producida por Aspergillus sojae en cultivos sumergidos, utilizando como fuente única de carbono y energía cáscara de naranja. A partir del seguimiento de la cinética de producción de A. sojae en un medio de cultivo compuesto por cáscara de naranja molida y (NH4)2SO4, se escogió cosechar el cultivo a las 168 horas desde iniciado, por ser el momento en el cual la actividad enzimática, determinada por dos métodos distintos, alcanzó valores máximos. Una vez obtenido un sobrenadante libre de biomasa y partículas provenientes del medio de cultivo, la purificación se realizó por medio de una serie de pasos cromatográficos de intercambio iónico y exclusión molecular. Según análisis electroforéticos, se obtuvo una fracción homogénea con un PM de 47 kDa y un pI de 4.2. A destacar, la enzima probó ser considerablemente estable frente a condiciones desde muy ácidas hasta neutras (pH 1.5-6.5) y presentó un valor de KM particularmente bajo, 0.134 mg/ml, lo que da cuenta de su elevada afinidad por su sustrato. En condiciones estáticas la PGasa resultó ser completamente estable hasta 45° C, y presentó una vida media de inactivación térmica de 2 horas a 50° C. Además de su actividad frente a ácido poligalacturónico (APG) y pectina, la enzima exhibió actividad solubilizadora de pectina, siendo su rango de actividad óptima sustrato-dependiente, si bien actúa mejor en un rango de pH concertado de 3.3-5.0. Los análisis por cromotografía en capa fina (CCF) revelaron que el tri-galacturonano es el principal producto final de hidrólisis de APG, indicando el carácter endo- de la PGasa. La enzima permaneció estable y su actividad inalterada frente a SO2, etanol y varios cationes ensayados excepto Hg2+, el cual inactivó la actividad por completo. Estas propiedades convierten a la endo-PGasa de A. sojae en un potencial candidato para ser utilizado en los procesos de extracción y clarificación de jugos de fruta, y durante la elaboración de vino en la etapa pre-fermentativa de desfangado de mosto. La tercera parte comienza con la descripción del proceso de obtención de un preparado pectolítico de A. sojae (PP-AS), desde el cultivo del microorganismo a partir de cáscaras de naranja hasta la obtención de una preparación sólida. PP-AS se caracterizó en términos de actividades enzimáticas relevantes para aplicación vinícola y luego se aplicó, por un lado, al mosto de uva blanca previo a la fermentación alcohólica para evaluar la promoción de la clarificación del mismo, y por otro lado, durante la maceración fermentativa en vinificaciones en tinto con el fin de estudiar su efecto en el desarrollo del color del vino y en su composición fenólica y aminoacídica. De todas las actividades enzimáticas cuantificadas bajo condiciones de vinificación (pH 3.50 y 20° C), la actividad PGasa fue previsiblemente la principal, y probó ser estable e inalterable frente al SO2. También se verificó la existencia de actividad XYLasa, aunque en cantidades menores, y es destacable la ausencia de actividad pectinesterasa, la cual contribuye en la producción indeseable de metanol. La adición de PP-AS al mosto de uva blanca promovió en un período de tiempo razonable una clarificación efectiva del mismo ya que a diferencia del mosto sin adición exógena de pectinasas, el cual clarificó pobremente, los niveles de turbidez alcanzados fueron los recomendados para asegurar una fermentación alcohólica adecuada sin que el producto final pierda características sensoriales. Finalizada la elaboración de vinos blancos, aquellos elaborados a partir de los mostos clarificados con PP-AS presentaron niveles significativamente mayores que los vinos control de ácido L-málico y significativamente menores de ácido L-láctico, hecho característico de la fermentación maloláctica e indicativo de un metabolismo activo de bacterias ácido lácticas. Este resultado es atribuible a un desfangado eficaz gracias a la adición de enzimas pectolíticas, ya que durante la clarificación la carga microbiana disminuye sensiblemente y los mostos desfangados son menos proclives de sufrir fermentaciones indeseadas. Respecto a las vinificaciones en tinto, las actividades enzimáticas de PP-AS promovieron una extracción comparativamente más rápida de materia colorante ya que se alcanzó la máxima intensidad de color antes que en los vinos control. Luego de seis meses de almacenamiento en bodega, los vinos elaborados con PP-AS presentaron concentraciones más elevadas de ácidos cumárico, cafeico y aspártico (p < 0.05), sugiriendo una extracción mejorada de los componentes contenidos en las células de la uva.

En esta tesis doctoral se plantearon tres ejes de trabajo con la finalidad de aportar nuevos conocimientos en relación a la generación de especies reactivas nocivas asociadas a la acción de antibióticos de uso clínico y nuevos derivados de síntesis. Es fundamental la comprensión del impacto fisiológico derivado del tratamiento con sustancias antimicrobianas para la investigación de nuevos blancos terapéuticos, como también la optimización de las terapias existentes. El primer aspecto de estudio involucró la investigación de la perturbación del estado redox en cepas de Staphylococcus aureus sensibles y resistentes a meticilina cuando fueron expuestas al antibiótico bacteriostático Linezolid (LZD). En este sentido, se exploraron los cambios inducidos por LZD en cepas productoras de biofilm y en cepas en estado planctónico, determinándose la acción antibiofilm de LZD. Además, se indagó si el estrés oxidativo estaba vinculado a la acción del agente bacteriostático LZD.   La segunda etapa de trabajo se focalizó en el estudio del daño oxidativo provocado por el antibiótico ciprofloxacina (CIP) con la particularidad de poder evaluar los daños y comprender el impacto fisiológico de un compuesto bactericida en tiempo real. Se estudió el fenómeno de peroxidación lipídica, uno de los eventos oxidativos más perjudiciales para las células, con una sonda fluorescente de gran sensibilidad. La intención de este análisis fue identificar en células individuales la lesión oxidativa y conocer la evolución de este proceso en el tiempo, así como poder visualizar y entender el metabolismo oxidativo desde una óptica muy cercana. Los resultados obtenidos revelaron heterogeneidad de lesiones oxidativas dentro de una población bacteriana proveniente de un mismo clon. De esta manera, se visualizó por primera vez en tiempo real y en bacterias individuales uno de los eventos oxidativos más nocivos para las células. El tercer eje de trabajo estuvo orientado a la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana. Los derivados de N-bencenosulfonilos evaluados presentaron actividad frente a cepas Gram negativas como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Gram positivas, S. aureus meticilino sensibles y resistentes. Se investigó la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) y especies reactivas del nitrógeno (ERN) en las diferentes cepas, con el objetivo de evaluar el estrés oxidativo inducido como también la lesión provocada en macromoléculas bacterianas por el desequilibrio oxidativo inducido. Un estudio teórico planteando un potencial receptor, permitió identificar un potencial blanco para estos derivados. Los compuestos ensayados representan prometedoras estructuras químicas para el desarrollo de nuevas clases de antimicrobianos sintéticos.
Mediante estos estudios pudimos concluir que el estrés oxidativo no presenta un rol preponderante cuando las bacterias son expuestas a un agente bacteriostático como LZD. Por su parte, el antibiótico bactericida CIP demostró la inducción de estrés oxidativo en tiempo real y por estudios de células únicas. Además, los derivados de síntesis también revelaron un efecto de tipo bactericida con elevación de especies reactivas en diferentes géneros bacterianos. Esto conlleva a reforzar la hipótesis de que la producción de especies reactivas está asociada a la muerte celular como parte de la acción de los compuestos bactericidas. 
 

El LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1) es un receptor que se encuentra expresado en diferentes tipos celulares tales como células gliales de Müller y cardiomiocitos. Entre las diversas funciones de este receptor se destaca su capacidad de regular la expresión y actividad de diferentes proteínas en la membrana plasmática, como ser el caso del receptor de insulina (IR). Se ha demostrado que la deficiencia de LRP1 en neuronas y hepatocitos genera resistencia a la insulina. En este sentido, la insulina estimula el tráfico de LRP1 a la superficie celular en adipocitos, hepatocitos y células musculares, aunque se desconoce cómo es la regulación de este tráfico intracelular. Esta movilización de LRP1 hacia la membrana plasmática, a su vez, le permitiría regular la actividad del IR en respuesta a la hormona.Numerosos estudios relacionan la resistencia a la insulina con el incremento de subfracciones aterogénicas de lipoproteínas de baja densidad, como las modificadas por agregación (agLDL). El exceso de estas lipoproteínas es almacenado en diferentes tejidos, como músculo e hígado, contribuyendo con la resistencia a la insulina, aunque el mecanismo a través del cual esto ocurre no es del todo claro. El LRP1 es uno de los receptores involucrados en la captación de colesterol esterificado desde agLDL, lo que podría tener relación con alteración de la respuesta a la insulina.Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar la relación funcional entre el tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina. Dentro de este marco general se plantearon los siguientes objetivos específicos: i) Identificar las estructuras vesiculares de almacenamiento de LRP1, así como las proteínas de transporte vesicular y las vías de señalización intracelulares implicadas en el tráfico hacia la membrana plasmatica de este receptor por acción de insulina; y ii) Establecer la participación de LRP1 sobre la respuesta celular a insulina, y cómo este evento es alterado por la presencia de ligandos como las agLDL.Como modelo experimental se utilizaron las líneas celulares: MIO-M1, células gliales de Müller de retinas humanas; y HL-1, cardiomiocitos de ratón. En cuanto al tráfico intracelular de LRP1 inducido por insulina en células MIO-M1, por microscopia confocal se evidenció un incremento significativo de la localización de LRP1 principalmente en endosomas tempranos [EEA1+] y en el compartimento de reciclado rápido [Rab4+] en presencia de insulina. Mediante ensayos de biotinilación de proteínas de superficie celular, se evidenció que insulina promueve la movilización de LRP1 hacia la membrana plasmática en estas células. Este tráfico de LRP1 hacia la membrana plasmática fue mediado por la activación de la vía de señalización intracelular IR/PI3K/Akt, evidenciado mediante ensayos de In- cell Elisa. Por microscopia electrónica de trasmisión se pudo identificar vesículas intracelulares de ≈100 nm, que almacenan LRP1 junto con otras proteínas características de estas estructuras como sortilin y VAMP2. Finalmente, insulina promovió el tráfico de LRP1 a la superficie celular a través diferentes vías posibles de reciclado y/o exocitosis, entre ellas, la vía de reciclado rápido [Rab4+] y la vía exocítica mediada por Rab8A y Rab10, como se pudo observar mediante ensayos de biotinilacion de proteínas de superficie celular.En cuanto a la participación de LRP1 sobre la respuesta celular a insulina, y como este evento es afectado por las agLDL en células HL-1, se demostró que el tratamiento con agLDL durante 8 horas produjo una acumulación significativa de colesterol esterificado evidenciada por extracción lipídica y cromatografía en capa delgada. La captación de estas lipoproteínas modificadas fue mediada por LRP1, ya que este efecto fue bloqueado por GST-RAP. Mediante microscopia confocal se evidenció que la interacción entre las agLDL y LRP1 promovió la localización del receptor en compartimentos de degradación del tipo endosomas tardíos o lisosomas, los cuales resultaron ser disfuncionales, y afectó la localización de este receptor en regiones celulares ricas en caveolina por acción de insulina. Mediante ensayos de inmunoprecipitación, se evidenció la alteración de la asociación molecular entre LRP1 e IR. A continuación, mediante Western blot, ensayos de marcación de proteínas de superficie con biotina y microscopia confocal, encontramos que las agLDL afectaron la activación de la cascada de señalización intracelular inducida por insulina lo que resultó en una reducción de la exocitosis hacia la membrana plasmática de GLUT4 y una menor captación de glucosa por acción de insulina en los cardiomiocitos expuestos a agLDL.En conclusión, la insulina regularía el tráfico de LRP1 hacia la membrana plasmática, principalmente desde vesículas intracelulares, a través de la activación de la cascada de señalización intracelular IR/PI3K/Akt, y en parte mediante una ruta de exocitosis regulada por insulina que involucraría la participación de Rab8A y Rab10. Este evento resulta en un aumento de la expresión de LRP1 en la superficie celular, lo cual tendría implicancias en la respuesta celular a la insulina. La presencia de un ligando específico de LRP1 como agLDL alteraría la distribución intracelular de este receptor, afectando la asociación molecular entre LRP1 e IR, la señalización intracelular inducida por insulina y la captación de glucosa extracelular en cardiomiocitos. Estos resultados en su conjunto presentan una nueva perspectiva en el estudio bioquímico y celular de la relación del tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina, lo que podría tener implicancias fisiopatológicas en los procesos de neovascularización y neurodegeneración retinal como así también en la alteración de la función cardíaca que se producen en situaciones de resistencia a la insulina.

Los hidrogeles magnéticos (o ferrogeles) con nanopartículas de magnetita en una matriz de PVA, poseen propiedades notables de absorción de agua, cambio de volumen por hidratación y por aplicación de campos, y liberación de fármacos. Estos materiales basan su respuesta en una concentración elevada de MNPs que pueden llegar a constituir del orden del 15 % de su masa. En esto contrastan con los coloides magnéticos para aplicaciones biomédicas, que poseen a lo sumo concentraciones másicas del orden del 1 %. El contraste es mucho mayor con los coloides empleados para magnetofección, que en el presente trabajo poseen una concentración másica del orden de 10^-4 %. La elevada concentración de MNPs en los ferrogeles permite estudiar con detalle el efecto de las interacciones dipolares magnéticas, que tienen una dependencia característica con el cubo de la inversa de la separación entre MNPs. El cambio de volumen que experimentan al hidratarse (de hasta tres o cuatro veces su volumen seco) permite sintonizar la intensidad de las interacciones, de manera que estos materiales son además un banco de pruebas ideal para desarrollar y testear modelos. En esta tesis se presenta un modelo que hemos denominado MFISP (por Mean Field Interacting Super-Paramagnet) basado en los conceptos de campo medio desmagnetizante e interacciones dipolares magnéticas entre partículas. Este modelo permite interpretar el cambio de respuesta debido a las interacciones a través de un tensor desmagnetizante que depende de unos pocos parámetros estructurales asociados a la distribución espacial de MNPs. Como se verá más adelante, a través de este modelo se puede inferir si las interacciones dipolares se manifiestan o no durante el proceso de magnetofección. Si bien el coloide magnetofectante posee una concentración de MNPs muy baja, la formación de complejos podrá agrupar de cientos a miles de MNPs por PVP. Además las MNPs internalizadas por el cultivo se concentran en endosomas celulares. La comparación de la respuesta magnética del coloide estable de MNPs, del coloide de MNPs y PVPs usado para magnetofección, y del cultivo internalizado permitió inferir que en todos los casos la intensidad de las interacciones dipolares fue despreciable. Ello posiblemente se debió a la eficacia de la gruesa capa polimérica que recubre las MNPs, la cual impone una distancia mínima entre sus carozos magnéticos.

En el presente trabajo se exploran las posibilidades de la técnica de hidrólisis de urea a temperaturas moderadas (80-90°C) para la preparación de precursores de óxidos mixtos cobre-zinc y cobre níquel. En primer lugar, se caracteriza el comportamiento de precipitación de los sistemas simples de los tres metales: Ni(II), Cu(II) y Zn(II). Mas adelante, se establecen las condiciones para una coprecipitación controlada, regulando la relación Cu(II):M(II) -M Ni o Zn-, la estructura, la morfología y el tamaño de las particulas obtenidas. Desde un punto de vista básico, se estudia la compatibilidad de iones d8 y d¹°,con el Cu(II). Los entornos de coordinación son completamente diferentes, tanto en la solución como en los sólidos. Por otro lado, estos sistemas tienen un definido interés en Química de Materiales, como algunos de los precursores (hidróxidos de Ni(II), ZnO, o CuO). Los óxidos CuO-ZnO tienen aplicación en la síntesis de metanol. La actividad de los mismos depende de la estructura de los carbonatos básicos precursores. Los óxidos Cu-Ni también tienen interés en catálisis. En la primera parte se estudia la evolución de los sistemas simples de Cu, Zn y Ni. Se describen los procesos que llevan de la solución a los sólidos, y su evolución a lo largo del envejecimiento en las soluciones de partida. Estos procesos involucran una compleja interrelación de las químicas acuosa y coloidal de cada metal. La segunda parte describe los mecanismos de precipitación de fases mixtas. En el caso del sistema Cu-Zn, un hidróxido amorfo mixto puede evolucionar a auricalcita, (Zn1-xCux)5(OH)6(CO3)2, malaquita zinciana Cu2-XZnx(CO3)(OH)2 (x<0,l), o tenorita sustituida (Cu1-xZnxO) (x<0,05), o mezclas, según la proporción de Zn/Cu. Los precursores obtenidos en el sistema Cu-Ni en condiciones de alta proporción de Ni(II) corresponden a α-Ni1-xCux(OH)2 turbostrático, malaquita niqueleana, Cu2-xNix(CO3)(OH)2(x<0,06). Los sistemas intermedios conducen a mezclas. El α-Ni1-xCux(OH)2 se revela como un excelente precursor de óxidos mixtos de Cu-Ni, generando CuxNi1-xO (x≤0.3).

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Hydrocolloids of different origins have wide application in different industries. Among them, gum Arabic (GA) leads the world market for gums used in microencapsulation. However, their periodic scarcity and costs, drive the search for alternative compounds. Brea gum (BG) is an exudate of Cercidium praecox tree similar to GA in composition and properties, and of national production. In this context, the objective of the thesis was to study the physicochemical, rheological and functional characteristics of BG, and the effect of different treatments on its emulsifying and encapsulating properties. The physicochemical characterization of BG presented 82.60% w/w of polysaccharides and 7.52% w/w of proteins. Three main fractions were determined: a polysaccharide of 2.79 x 103 kDa, majority; a protein-polysaccharide complex of 1.92 x 105 kDa and a protein fraction of 6 to 66 kDa. The aqueous solutions presented a pseudoplastic behavior at low deformation rates and Newtonian fluid at higher speeds. The emulsifying capacity was evaluated with 10 and 20% w/w solutions, obtaining small droplets (500-600 nm) and high stability. Corn oil and limonene were microencapsulated by spray drying. At higher concentrations of BG, higher corn oil encapsulation efficiency and greater retention and protection from oxidation of limonene were obtained. Finally, physical methods for BG modification were evaluated, among which the thermal treatment achieved remarkable improvements in the emulsifying and encapsulating properties.

El género Azotobacter agrupa varias especies da microorganismos aerobios capaces de fijar al nitrógeno molecular atmosférico. Beijerinck, en 1901, descubrió la existencia da éstos gérmenes, aislándolos de suelos y aguas del canal de Delft. En el presente trabajo se citan, en breve reseña histórica, los investigadores que han profundizado en este tema describiendo nuevas especies aisladas de distintos suelos, como asimismo, las diversas opiniones vertidas respecto a las especies que merecen ser consideradas. En el siguiente capítulo se describen distintas espacies de Azotobacter, su metabolismo carbonado y nitrogenado y las influencias que sobre ellos ejercen los factores físicos y químicos. A continuación, ilustrando con algunas fotografías, se detallan los métodos y técnicas ensayados para el aislamiento da gérmenes del grupo Azotobacter, utilizando medios líquidos y solidificados y también medios naturales y placas de gel silíceo. En capítulo aparte, se puntualizan, en un cuadro, las especies de Azotobacter identificadas en 55 de las 45 muestras da tierra del país examinadas, detallando los medios nutritivos utilizados y el estudio de los caracteres morfológicos, tintoriales y fisiológicos efectuado, citando los métodos de coloración empleados.

El presente estudio está dirigido a obtener información básica sobre el rol que cumplen las características fisicoquímicas y estructurales de las proteínas de soja y las interacciones que se establecen entre ellas y con el medio que las rodea en la expresión de su funcionalidad. Ello contempla evaluar una serie de propiedades fisicoquímicas y funcionales de un conjunto de aislados proteicos de origen comercial y establecer las relaciones existentes entre ellas. Se intenta además determinar la incidencia del tratamiento térmico y de la presencia de iones calcio sobre la funcionalidad de aislados proteicos obtenidos en el laboratorio. Asimismo, se pretende analizar el proceso de desnaturalización por calor de las proteínas 7S y 11S parcialmente purificadas y de aislados proteicos preparados en el laboratorio y determinar los parámetros cinéticos asociados al mismo.

Noguera, M. E. (2012). Estudio de las propiedades estructurales y mecanismo de plegado de la superfamilia de módulos SEA (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.