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La Gliadina es una proteína presente en el trigo, avena, centeno y cebada, que no es completamente degradada durante el proceso de la digestión, produciendo varios péptidos, entre ellos el 33-mer. Este péptido se conoce por ser el principal inmuno-modulador de la patología celíaca, provocando un desbalance entre la tolerancia y auto-inmunidad. En esta tesis se presenta el estudio estructural y la elucidación de la auto-organización de la proteína gliadina y de su péptido 33-mer en medio acuoso y sobre superficies, mimetizando condiciones fisiológicas in vitro. En primer lugar, se determinó que la proteína gliadina se auto-organiza espontáneamente formando agregados solubles a pH 3.0. Cuando se cambió el pH a 7.0, se observó una separación de fases, con disminución de la concentración y cambio en la composición aunque permanecieron ciertas nano-estructuras y agregados amorfos en solución. Si bien no se observaron modificaciones en la estructura secundaria a ambos pHs, se detectó una exposición diferencial de los residuos aromáticos como Tirosina y Triptófano, lo cual puede deberse a un cambio en la estructura terciaria. Por técnicas bioinformáticas, se determinaron probables sitios hidrofóbicos, residuos expuestos al solvente y regiones con capacidad de agregarse, los cuales podrían explicar los hallazgos experimentales observados. Por otro lado, el fluoróforo Rojo Nilo presentó una unión en el orden micromolar solo a pH 3.0, lo cual sugiere la presencia de sitios hidrofóbicos accesibles en los agregados solo a este pH. Estos resultaron sugieren que a pH 3.0 el sistema se organiza en nano- estructuras tipo micelares, mientras que a pH 7.0, las estructuras presentaron una disminución de la carga neta de la superficie (desde + 13 a pH 3.0, a + 4 mV a pH 7), llevando a la formación de nano- partículas coloidales que no interactúan con el Rojo Nilo. En segundo lugar, se evaluaron las características estructurales del péptido 33-mer mediante dicroísmo circular y espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier -reflectancia total atenuada, se ha demostrado que el 33-mer se encuentra en un equilibrio conformacional random coil/PPII y PPII/β paralela, dependiente de la concentración. Mediante dinámica molecular y distribución de cargas parciales fue posible observar que el péptido se comporta como una molécula anfifílica y es capaz de asociarse formando al menos un dímero estable. En agua a pH 7.0 se observaron oligómeros manométricos y estructuras fibrilares por microscopia electrónica. La presencia de oligómeros en solución del péptido 33-mer fue confirmado mediante anisotropía y fluorescencia resuelta en el tiempo del residuo Tirosina y DLS-Correlación 3D, detectando que 33-mer es un sistema polidisperso dinámico con partículas de tamaños entre los nano y micrómetros en todo el rango de concentraciones analizado (125-610 μM). La microscopia de fuerza atómica del péptido 33-mer en función de la concentración sobre mica confirmó la capacidad de 33-mer de formar nano y micro-estructuras con diferentes morfologías. Se observó a bajas concentraciones clusters de nanoesferas. A concentraciones intermedias oligómeros esféricos asociándose en arreglos lineales, anulares y estructuras similares a placas. A altas concentraciones, se observaron filamentos y placas rodeadas por nanoesferas, con una disposición del tipo fractal. Este tipo de organización se produce mediante un mecanismo de Agregación Limitada por la Difusión. Por otro lado, se evaluaron los oligómeros del péptido 33-mer sobre dos superficies hidrofóbicas miméticas al intestino, como el HOPG y el dióxido de silicio. En el HOPG se detectaron estructuras de morfología similar a las obtenidas en mica. En la superficie de dióxido de silicio, el auto-ensamblado del 33-mer fue dinámico y dependiente de las condiciones de preparación de la muestra, obteniéndose agregados a través de un mecanismo de percolación. Finalmente, la morfología de las nano-estructuras presentes a 600 μM se resolvió mejor utilizando un microscopio de ion Helio, detectando además de las estructuras mencionadas anteriormente, de nano-cilindros, los cuales se proponen como intermediarios en la formación de las fibras detectadas. La capacidad de formación de nano-estructuras de variadas morfologías de la gliadina y de su péptido 33-mer in vitro y el hecho que estas posean una estructura secundaria característica podría ser un conocimiento fundamental en el estudio de las patologías relacionadas con el gluten

En esta tesis se estudiaron catalizadores para la combustión catalítica de hollín generado por motores diesel. Estos catalizadores son necesarios para disminuir la temperatura a la cual el hollín se quema, y pueda ser posible su eliminación en el rango de temperaturas en las que normalmente opera un vehículo. El sistema reaccionante es complejo. Involucra dos fases sólidas, hollín y catalizador, y una fase gaseosa. Las fases involucradas deben estar en contacto para que la reacción de combustión catalítica se pueda llevar a cabo. Se evaluó el comportamiento catalítico de los óxidos de cerio, de magnesio y de lantano, prestando especial atención al óxido de cerio. Se estudiaron además catalizadores de metales alcalinos soportados sobre los óxidos mencionados. Se evaluaron diferentes cationes: sodio, potasio y cesio. Para el caso del sodio y del potasio se estudió el efecto que tiene la sal precursora. Se propuso un mecanismo de reacción heterogéneo para el caso en el que se emplea óxido de cerio como catalizador. Tomando este mecanismo como referencia, se propusieron además mecanismos para el caso en el que se ha empleado potasio como promotor partiendo de los diferentes precursores y también para las diferentes cargas metálicas obtenidas con nitrato de potasio. En todos los casos los resultados de las regresiones no lineales, como así también las simulaciones realizadas con los diferentes modelos fueron satisfactorias, pudiéndose simular incluso fenómenos no reportados hasta la fecha y que no pueden ser reproducidos por los modelos pseudohomogéneos del tipo ley de potencia.

Los vegetales frescos cortados son altamente perecederos y es por esto que hoy en día se estudian alternativas que empleen productos naturales y que complementados con la refrigeración permitan alargar la vida útil de los mismos. Es así que en el presente trabajo se estudió el efecto del empleo de aceites esenciales de especias sobre la calidad nutricional, sensorial y microbiológica de tomate fresco cortado almacenado en atmósfera modificada y refrigeración. En una primera instancia se realizó una prueba sensorial de aceptabilidad por atributos para elegir el estado de madurez del tomate cortado en rodajas y una prueba de ordenamiento por preferencia para seleccionar la forma de presentación del mismo. Es así que resultó seleccionado el estado rojo claro presentado en bandeja rectangular de telgopor. Luego se evaluó el efecto de los aceites esenciales de laurel y romero durante el almacenamiento en atmósfera modificada y refrigeración. Así, los tomates de madurez rojo claro fueron lavados, desinfectados (ClONa 150 ppm, 5 min), secados y cortados en rodajas de 7 mm. Se colocaron 6 rodajas por bandeja, aceite esencial (AE) de laurel y romero (0, 15, 30, 50 y 100 uL) en un papel de filtro sobre un lateral de la bandeja y se envasaron con film PD 961 (Cryovac®) para almacenarlos a 5°C por 13 d. Los respectivos controles no se envasaron con AE. La mejor combinación esencia-concentración se seleccionó utilizando un índice visual que contempló la presencia de hongos, bacterias, exudado y deterioro en las rodajas. El AE de romero (30 y 50 uL) y laurel (30 uL) mostraron un menor índice de deterioro respecto de los controles, aunque el más efectivo fue el AE de romero (30 uL). Esta combinación logró un menor índice de daño de las rodajas de tomate al disminuir el ataque de microorganismos y lograr un mejor aspecto general al cabo de los 13 días. Esta combinación (AE de romero, 30 uL) se empleó en un segundo ensayo en cual se observó que produjo un menor ablandamiento de las rodajas a partir del día 8, sin afectar significativamente la pérdida de peso, el contenido de sólidos solubles y la acidez de las rodajas de tomate rojo claro respecto de las rodajas de tomate control. El tomate mínimamente procesado continuó con la maduración ya que los parámetros de color así lo demostraron, aunque no hubo diferencias entre rodajas controles y tratadas. Si bien la capacidad antioxidante (medida con los radicales DPPH y ABTS+) y el contenido de fenoles totales (empleando el reactivo de Folin-Ciocalteau) y ácido ascórbico (por HPLC-DAD) disminuyeron durante el almacenamiento refrigerado no hubo diferencias significativas entre muestras control y tratadas.También se logró una atmósfera modificada pasiva que alcanzó niveles cercanos a 17:2% de O2:CO2.Se identificó (por CG-MS) la presencia de los compuestos volátiles -pineno, canfeno, p-cimeno, 1,8-cineol y L-canfor en el AE de romero empleado. Mientras que, luego de 4 d de almacenamiento, el 1,8-cineol y L-canfor fueron los compuestos mayoritarios en la atmósfera de las bandejas tratadas y los únicos presentes en las rodajas de tomate. Por otro lado, el empleo de AE de romero (30 uL) retrasó significativamente el recuento de bacterias mesófilas totales, hongos y levaduras. A partir de dicha flora nativa se aisló tanto un hongo filamentoso y se identificó mediante claves taxonómicas como Aspergillus fumigatus, como dos levaduras que se identificaron como Candida guilliermondii y Kloeckera spp. mediante el kit API® 20C AUX. Se enfrentaron distintas concentraciones de estos microorganismos ante 30 uL de AE de romero, hallándose que A. fumigatus fue más susceptible que C. guilliermondIi y Kloeckera spp. También se analizaron distintas concentraciones de AE frente a la concentración sensible de microorganismos, hallándose que dichos % de inhibición se incrementaban con la cantidad de AE, siendo A. fumigatus el microorganismo más sensible. Los resultados muestran que el empleo de AE de romero en combinación con un empaque en atmósfera modificada pasiva y refrigeración permite mantener en mejor condición a rodajas de tomate. No se vio mayormente afectada la calidad nutricional y sensorial respecto de las muestras controles, pero si se logró mantener una mejor calidad microbiológica. El AE de romero ejerció un efecto antimicrobiano a diferentes concentraciones para la flora nativa aislada e identificada: A. Fumigatus, Candida guilliermonddi y Candida spp. Los compuestos terpénicos adsorbidos en el tomate y mayoritarios en la atmósfera que rodea al tejido fueron 1,8-cineol y L-canfor, por lo que pareciera ser que estos compuestos serían los responsables del efecto antimicrobiano observado y que permitió finalmente incrementar el tiempo de vida útil del tomate fresco cortado almacenado en atmósfera modificada y refrigerado.

Al momento de iniciar los estudios que dieron lugar a la presente Tesis Doctoral, la identificación de organismos del cBc en nuestro país presentaba serias limitaciones. Los métodos utilizados a nivel hospitalario eran las técnicas bioquímicas de rutina y los estudios de resistencia a antimicrobianos se hacían empleando los métodos de determinación de CIM convencionales. La epidemiología del cBc en Argentina era muy poco conocida y las metodologías de identificación basadas en técnicas de PCR (PCR-recA primers EE) se encontraban limitadas a un solo nosocomio. Asimismo, en los principales centros de atención de FQ del país se registraba en el año 2004 un aumento considerable de aislamientos de bacterias cuya tipificación era compatible con miembros de cBc. Esta situación fue motivo de gran preocupación en los centros de salud debido a que la identificación del cBc, a nivel de género, solía demorar entre 3–7 días debido a la naturaleza de las técnicas fenotípicas disponibles y en consecuencia esto implicaba una retraso en el inicio del tratamiento antimicrobiano y de las prácticas de aislamiento de los pacientes. En este contexto era de suma necesidad contar con un método rápido, económico y confiable que permitiera la identificación de los principales patógenos respiratorios recuperados de muestras de pacientes FQ y en especial de organismos del cBc. Esta situación motivó a Servicios de Bacteriología de hospitales locales (Hospital de Niños y Rossi de La Plata) a requerir de nuestro Instituto la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias de identificación de estos organismos. Ese año 2004 se registró un importante aumento en el número de aislados del cBc en una sala de pacientes FQ del Hospital de Niños de La Plata. Los aislados no pudieron ser discriminados a nivel de especie por el servicio de bacteriología local. A partir de esta situación de base los objetivos generales de este trabajo fueron desarrollar métodos rápidos, sencillos y precisos que permitieran la discriminación e identificación de especies estrechamente relacionadas del cBc y de BNF presentes en infecciones pulmonares de pacientes FQ. Para este objetivo se decidió estudiar la aplicación de nuevas tecnologías fisicoquímicas basadas en la espectroscopía FT-IR y la espectrometría de masa MALDI-ToF. Asimismo se consideró evaluar la acción de antimicrobianos comúnmente empleados en el tratamiento de infecciones pulmonares causadas por el cBc empleando la metodología convencional y el modelo de crecimiento en biofilm. En particular se propuso estudiar en detalle los siguientes ítems: 1.- Desarrollar el empleo de la espectroscopía FT-IR y métodos de análisis multivariantes (análisis de cluster y redes neuronales artificiales) como herramienta para la discriminación e identificación de especies pertenecientes al cBc y BNF relevantes en infecciones pulmonares de pacientes con FQ. 2.- Evaluar el uso de la espectrometría de masa MALDI-ToF mediante detección de biomarcadores específicos y análisis multivariante que conduzcan a la discriminación e identificación de especies pertenecientes al cBc y BNF relevantes en FQ. 3.- Determinar el perfil de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos de especies del cBc procedentes de centros nosocomiales y del ambiente por test convencionales. 4.- Evaluar el efecto de los agentes antimicrobianos en cultivos en biofilms de aislados clínicos y ambientales del cBc.

El plan de tesis propuesto tiene como objetivo general “evaluar la utilización de polímeros impresos nanoestructurados como fases sensoras en el desarrollo de sensores ópticos para la determinación selectiva de benzodiazepinas”. A continuación se mencionan los objetivos específicos que han dirigido el desarrollo de este trabajo de investigación: • Estudiar las propiedades ópticas de las benzodiazepinas y las condiciones bajo las cuales se produce la hidrólisis de las mismas. La caracterización luminiscente incluye el registro de los espectros de absorción UV, excitación/emisión de fluorescencia y de fosforescencia a temperatura ambiente. • Investigar la manera en que las benzodiazepinas interaccionan con biopolímeros. Esto da una idea de los enlaces que hay que intentar reproducir a través de fases sensoras artificiales, que tienen la capacidad de sustituir la función que desempeñan las sustancias bioquímicas. • Sintetizar polímeros impresos con benzodiazepinas utilizando diferentes tipos y concentraciones de precursores, optimizando las condiciones de síntesis para maximizar el proceso de impresión. • Evaluar las propiedades de reconocimiento selectivo de los polímeros sintetizados para seleccionar aquel que presente las mejores características para ser utilizado como fase sensora. • Explorar la utilización de las fases sensoras seleccionadas como medio de reconocimiento selectivo en la fabricación de sensores que permitan el análisis por inyección en flujo de benzodiazepinas. En esta etapa es necesario establecer un diseño del dispositivo de medida según las variables instrumentales y optimizar las condiciones de análisis. • Evaluar el desempeño analítico de los ensayos fluorescentes para la cuantificación de benzodiazepinas, como así también la reactividad cruzada frente a analitos estructuralmente relacionados. • Aplicar el método desarrollado al análisis de muestras reales y comparar los resultados con aquellos que se obtienen utilizando otros métodos.